鼻咽癌細(xì)胞放射抗拒的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、[研究背景及目的]
　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國常見的惡性腫瘤之一，以南方地區(qū)尤為高發(fā)，放療被認(rèn)為是首選的治療手段。然而，臨床上部分病人放療后出現(xiàn)局部殘留與局部復(fù)發(fā)，腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在放射抗拒性是重要原因之一。目前國內(nèi)外在基因水平上對腫瘤放射抗拒機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌中表達(dá)中能良好預(yù)測腫瘤放射抗拒性及其預(yù)后的基因或蛋白，據(jù)推測主要原因可能為mRNA的表達(dá)豐度與其相應(yīng)的蛋

2、白質(zhì)表達(dá)水平的不一致性造成的。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為從蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)一步探討鼻咽癌放射抗拒機(jī)制提供可能性。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已普遍應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究的多個(gè)領(lǐng)域，它可從整體分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組分，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而揭示蛋白質(zhì)功能及生命活動(dòng)規(guī)律。目前，鼻咽癌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中于鼻咽癌的早期診斷和篩選腫瘤標(biāo)志物等方面。以體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞為研究對象，可以避免臨床組織樣本引起的組織異質(zhì)性、影響因素復(fù)雜、陽

3、性結(jié)果易丟失等諸多缺點(diǎn)。因此，從體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系開始逐步過渡到臨床成為當(dāng)今研究放射抗拒機(jī)制的主要方法之一。
　　本研究通過建立和優(yōu)化細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備方法，再對具有穩(wěn)定放射抗拒性的鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2R及其親本細(xì)胞系CNE-2進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，從而找到與放射抗拒相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。擬在蛋白質(zhì)表達(dá)水平初步闡明鼻咽癌放射抗拒的分子機(jī)制，也為今后臨床預(yù)測鼻咽癌病人個(gè)體放射敏感性并實(shí)施個(gè)體化放療提供新的思路。
　　[研

4、究方法]
　　1、分別采用三種方法對人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2進(jìn)行總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析，建立穩(wěn)定性與重復(fù)性俱佳的細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品制備方法。
　　2、分別提取處于對數(shù)生長期的具有穩(wěn)定放射抗拒性細(xì)胞株CNE-2R及其親本細(xì)胞株CNE-2的總蛋白，進(jìn)行雙向凝膠電泳。
　　3、電泳后經(jīng)硝酸銀染色，應(yīng)用ImageMaster2-DE Platinum5.0軟件對凝膠進(jìn)行分析，表達(dá)水平相差2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)為差異蛋白點(diǎn)，切取膠上

5、的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并行脫色、酶解、萃取，為后續(xù)質(zhì)譜分析奠定基礎(chǔ)。
　　4、應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)對選取的差異蛋白斑點(diǎn)，進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定分析。在Mascot蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索，進(jìn)行蛋白的鑒定，通過人工檢索文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫，深入分析蛋白質(zhì)的功能。
　　[研究結(jié)果]
　　1、采用通用裂解液裂解細(xì)胞，等電聚焦前在樣品中加入Destreak試劑，可以獲得穩(wěn)定性好、圖像清晰、分辨率高的雙向電

6、泳圖譜。
　　2、通過雙向凝膠電泳技術(shù)，使具有穩(wěn)定放射抗拒性細(xì)胞株CNE-2R及其親本細(xì)胞株CNE-2的總蛋白得到較好的分離，并篩選出32個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。
　　3、32個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中有16個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被成功鑒定，通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的蛋白為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、分子伴侶、細(xì)胞骨架成分，在生物學(xué)功能方面主要與凋亡調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控、RNA轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架組成和輻射應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)。
　　4、其中STM

7、N1在CNE-2R中明顯上調(diào)，NPM、hnRNP、AnnexinA3在CNE-2R中明顯下調(diào)，NM23僅在CNE-2R中特異表達(dá)，表明這5種蛋白質(zhì)可能參與鼻咽癌輻射抗拒機(jī)制的形成，具備深入研究的價(jià)值。
　　[研究結(jié)論]
　　2-DE結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)能夠有效地識(shí)別和鑒定鼻咽癌放療抗拒細(xì)胞與其親本細(xì)胞系之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。本研究共發(fā)現(xiàn)16個(gè)差異蛋白，提示鼻咽癌放射抗拒機(jī)制的發(fā)生是多種蛋白質(zhì)共同作用的結(jié)果。其中S