AML1-ETO陽性白血病APP基因的臨床意義、生物學(xué)功能及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究通過檢測(cè)44例AML1/ETO陽性的AML患者BMMNCs中APP的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平高低與臨床療效及預(yù)后的關(guān)系，從而明確APP基因在該類型白血病患者的臨床意義。進(jìn)一步通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)穩(wěn)定抑制伴有AML1/ETO融合基因陽性的Kasumi-1細(xì)胞系中的APP基因表達(dá)，觀察APP基因表達(dá)沉默對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為的影響，并初步探討了A

2、PP基因在調(diào)控AML1/ETO陽性白血病細(xì)胞遷移中的作用機(jī)制及藥物panobinostat干預(yù)，從而為探索AML1/ETO陽性的AML患者新的治療策略提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集我院2007年6月～2013年12月期間確診為AML的住院患者骨髓標(biāo)本44例（均為初診患者），且該44例患者經(jīng)染色體核型分析、原位熒光免疫雜交(FISH)和PCR檢測(cè)證實(shí)均存在t(8;21)(q22;q22)染色體異位和AML1/ETO融合基

3、因表達(dá)陽性。采用人外周血淋巴細(xì)胞分離液分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)患者BMMNCs中APP mRNA相對(duì)于內(nèi)參β-actin的表達(dá)水平。
　　2.以APP基因的mRNA表達(dá)中位水平為界，把低于和高于中位表達(dá)量的患者分成APP高表達(dá)組和APP低表達(dá)組。分析比較兩組患者白血病髓外浸潤(rùn)（EMI）發(fā)生率、2療程總完全緩解(complete remission,CR)率，分析APP表達(dá)水平高低與AML1/ETO陽性的AM

4、L患者預(yù)后的關(guān)系。
　　3.利用RNAi技術(shù)抑制Kasumi-1細(xì)胞中的APP基因以研究其功能。應(yīng)用熒光定量PCR和westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)shRNA對(duì)Kasumi-1細(xì)胞中APP基因的干擾效果。
　　4.觀察APP基因表達(dá)穩(wěn)定沉默對(duì)Kasumi-1細(xì)胞增殖、周期、凋亡、分化和遷移能力的影響。
　　5.基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)

5、成分，在腫瘤細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮重要作用，其中MMP1、MMP2和MMP9已知與多種腫瘤細(xì)胞遷移密切相關(guān)。
　　6.Panobino stat藥物以不同濃度作用于Kasumi-1細(xì)胞，CCK8法檢測(cè)藥物作用48小時(shí)的IC50值。以明確panobinostat是否能有效干預(yù)APP介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　結(jié)果：
　　1.檢測(cè)44例AML1/ETO陽性的AML患者BMMNCs中APP mRNA的相對(duì)表達(dá)中位水平為0.0097

6、93(0.0000413～0.08367)。
　　2.Kasumi-1細(xì)胞中的APP相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的蛋白表達(dá)水平(1.3423±0.1152)顯著高于HL-60細(xì)胞(0.6254±0.0846，P＜0.001)和K562細(xì)胞(0.8227±0.0974,P＜0.001)，由此證實(shí)了APP在AML1/ETO陽性的Kasumi-1細(xì)胞中高表達(dá)。慢病毒轉(zhuǎn)染Kasumi-1細(xì)胞72h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)無菌分選出Lv-shCon和Lv

7、-shAPP兩實(shí)驗(yàn)組GFP陽性的細(xì)胞并在體外擴(kuò)大培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Lv-shCon組的細(xì)胞GFP陽性率為(96.04±0.17)％、Lv-shAPP組的細(xì)胞GFP陽性率為(95.82±0.18)％，提示慢病毒成功轉(zhuǎn)染Kasumi-1細(xì)胞。
　　3.APP基因表達(dá)抑制后Kasumi-1細(xì)胞在24、48、72和96h時(shí)間點(diǎn)的OD450平均值稍低于對(duì)照組（Con和Lv-shCon組），說明細(xì)胞的增殖能力輕度受損，然而差異經(jīng)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義(P＞0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析三組細(xì)胞的周期分布情況，發(fā)現(xiàn)Lv-shAPP組細(xì)胞G0/G1期的比例與Con組比較無顯著差異(36.37±3.73 vs36.25±9.01，P=0.985)，S期和G2/M期的比例分別與Con組比較(28.19±6.08 vs26.21±5.13，P=0.663;33.07±2.74 vs34.25±2.92，P=0.771），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞術(shù)分析三個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡比例結(jié)果示，Lv-

9、shAPP組細(xì)胞總凋亡率（即早期和晚期細(xì)胞凋亡率之和）平均值稍高于Con和Lv-shCon組。然而，Lv-shAPP組細(xì)胞的總凋亡率與Con組和Lv-shCon組比較，差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件分析均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（8.40±0.96％ vs6.80±0.46％，P=0.065;8.40±0.96％vs7.10±1.06％，P=0.116）。Lv-shAPP組的Kasumi-1細(xì)胞CD11b陽性比例為6.63±0.66％，與Con組(5.69±0.5

10、0％)和Lv-shCon組的細(xì)胞CD11b陽性率(6.29±0.50％)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。采用Transwell小室檢測(cè)沉默APP表達(dá)后細(xì)胞體外遷移運(yùn)動(dòng)能力的變化，下室細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lv-shAPP組下室細(xì)胞比例(7.50±0.83％)較對(duì)照組顯著減少(12.78±2.1％，P=0.004)。結(jié)果表明APP基因表達(dá)沉默后Kasumi-1細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力顯著降低，對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和周期的

11、影響較小。
　　4.APP基因表達(dá)沉默后，western blotting方法檢測(cè)MMP2的蛋白水平顯著減低(P＜0.001)，而MMP1和MMP9的表達(dá)無顯著改變（P值均＞0.05）。檢測(cè)MMPs的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c-Myc和Ets1的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與Con組的c-Myc表達(dá)水平(0.7024±0.0179)和Ets1的表達(dá)水平(0.1035±0.0177)比較，Lv-shAPP組的c-Myc蛋白水平顯著下調(diào)(0.0896±

12、0.0160，P＜0.001)，而Ets1的表達(dá)水平無顯著改變(0.0996±0.0097，P=0.727)。其中Lv-shCon和Con組比較，c-Myc和Ets1的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。進(jìn)一步檢測(cè)c-Myc的上游調(diào)控基因p-ERK和ERK的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Con組的p-ERK表達(dá)水平(0.1666±0.0162)比較，Lv-shAPP組的p-ERK蛋白水平顯著下調(diào)(0.0183±0.007，P＜0.00

13、1)，三組細(xì)胞的ERK表達(dá)水平相互比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。
　　5.Panobino stat(PS)對(duì)Kasumi-1細(xì)胞的抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性，對(duì)Kasumi-1細(xì)胞作用48h的IC50濃度為20nM。Panobinostat以不同濃度5、10、20、40和80nM分別作用Kasumi-1細(xì)胞48h，Western blotting檢測(cè)結(jié)果示APP、p-ERK、c-Myc和MMP2的表達(dá)水平均隨著p

14、anobinostat濃度的增加而下調(diào)，呈濃度依賴性。說明Panobinostat能夠有效抑制APP基因的表達(dá)，從而干預(yù)APP介導(dǎo)的信號(hào)通路。另外，panobinostat抑制APP基因表達(dá)的藥物濃度，同時(shí)能顯著抑制Kasumi-1細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和導(dǎo)致細(xì)胞壞死。
　　結(jié)論：
　　1.AML1/ETO陽性AML患者中，APP基因高表達(dá)組的髓外浸潤(rùn)發(fā)生率顯著高于低表達(dá)組，且CR率、OS率和RFS率均顯著低于APP基因低表

15、達(dá)患者，同時(shí)OS期和RFS期也顯著短于APP基因低表達(dá)組。提示APP基因高表達(dá)是一個(gè)AML1/ETO陽性的AML患者預(yù)后不良的因素。
　　2.慢病毒介導(dǎo)的APP特異性shRNA序列能有效地穩(wěn)定抑制Kasumi-1細(xì)胞的APP基因表達(dá)，APP基因表達(dá)穩(wěn)定抑制能顯著減弱Kasumi-1細(xì)胞的體外遷移能力，而無顯著抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的效應(yīng)。
　　3.APP基因表達(dá)抑制后檢測(cè)到MMP2、c-Myc和p-ERK的

16、蛋白水平顯著減低，說明APP基因可能通過ERK信號(hào)通路介導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞的遷移能力。因此，APP/ERK/c-Myc/MMP2信號(hào)通路可能是APP基因調(diào)控AML1/ETO陽性的白血病細(xì)胞的遷移機(jī)制之一。
　　4.組蛋白去乙?；敢种苿﹑anobinostat作用能顯著下調(diào)Kasumi-1細(xì)胞中的APP、p-ERK、c-Myc和MMP2的表達(dá)水平，呈濃度依賴性，說明panobinostat能夠有效抑制APP基因的表達(dá)，從而干預(yù)