Homer1a在創(chuàng)傷性腦損傷中的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是致死致殘的重要病因之一。在美國每年約有200萬人發(fā)生TBI，幾乎三分之一腦損傷的患者是兒童和青年人群。在世界范圍內(nèi)，TBI的發(fā)生率還在不斷增加，交通事故、人身攻擊等是TBI發(fā)生的主要原因，尤其是機動車輛的廣泛使用，以及戰(zhàn)爭環(huán)境下的爆炸傷是導(dǎo)致TBI的重要原因。
　　創(chuàng)傷性腦損傷的傷情非常復(fù)雜，可能會導(dǎo)致不同程度的挫傷、彌漫性軸索損傷、出血、缺氧和神經(jīng)退行性疾病，從病理生理學(xué)角度上，創(chuàng)傷

2、性腦損傷大致可分為兩個階段即：原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損害，原發(fā)性損傷源于環(huán)境中機械外力直接作用于顱骨和腦，瞬間造成腦部神經(jīng)細(xì)胞死亡，屬于不可逆的機械損傷。而繼發(fā)性腦損害是指在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，所產(chǎn)生的后續(xù)腦組織損傷，可持續(xù)少至數(shù)小時，多達(dá)數(shù)天。繼發(fā)性腦損害機制包括一系列過程，如興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放（谷氨酸興奮毒性）、線粒體功能障礙、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)降解、炎性反應(yīng)、鈣超載和自由基損傷等。上述機制被證明與細(xì)胞早期死亡、程序性細(xì)胞死亡以及

3、細(xì)胞內(nèi)部的自噬相關(guān)，此過程需要比較長的時間，其中還存在許多可調(diào)節(jié)的生物分子靶點，這些生物分子靶點研究在創(chuàng)傷性腦損傷的診斷和治療中可能發(fā)揮重要作用，因此，對繼發(fā)性神經(jīng)損害相關(guān)的生物靶向分子和信號通路進(jìn)行調(diào)控，已逐漸在治療創(chuàng)傷性腦損傷中形成共識。據(jù)研究報道，Homer是重要的突觸后致密物的支架蛋白，Homer1作為Homer蛋白家族的一員，具有形成突觸結(jié)構(gòu)和介導(dǎo)突觸后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。進(jìn)一步研究證明，由即早基因編碼的Homer1亞型蛋白，具有

4、調(diào)節(jié)受體聚集和轉(zhuǎn)運、維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和形成細(xì)胞內(nèi)分子復(fù)合物等功能。大量的臨床前研究已經(jīng)證明，Homer1亞型蛋白與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如疼痛、精神發(fā)育遲緩綜合征，阿爾茨海默病、精神分裂癥、藥物成癮癥和創(chuàng)傷性腦損傷等疾病相關(guān)。Homer1a（也稱為vesl-1，短型Homer1），是第一個被分離出來的Homer亞型蛋白。研究表明，Homer1a蛋白由即早基因（IEG）編碼，正常狀態(tài)下維持低水平表達(dá)，在神經(jīng)元激活后表達(dá)量迅速增高。然而，單一的

5、生物標(biāo)記物不足以反映腦組織損傷的全譜。病理狀態(tài)下的關(guān)鍵分子、信號通路和網(wǎng)絡(luò)依然有待于深入探索。
　　實驗?zāi)康?
　　本研究目標(biāo)：(1)建立穩(wěn)定的腦損傷模型并觀察其病理學(xué)、形態(tài)學(xué)及行為學(xué)變化。使用蛋白質(zhì)譜的方法系統(tǒng)性鑒定分析創(chuàng)傷性腦損傷后蛋白的變化差異，為其潛在的發(fā)生機制提供新依據(jù)。(2)研究Homer1a蛋白在創(chuàng)傷性腦損傷后的改變與作用，并使用蛋白質(zhì)譜的方法探索Homer1a下游分子網(wǎng)絡(luò)及信號通路的變化，包括MAPK及Not

6、ch等。
　　實驗方法:
　　(1)動物模型：使用C57BL/6小鼠建立重物自由落體閉合性腦損傷模型；(2)腦損傷的評估:腦含水量和神經(jīng)功能評分；(3)病理學(xué)：HE染色、免疫熒光、免疫組化及TUNEL染色；(4)分子生物學(xué)：實時熒光定量PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR及免疫印跡法進(jìn)行研究；(5)動物行為學(xué)：曠場實驗、高架迷宮實驗及水迷宮實驗；(6)Homer1a表達(dá)調(diào)節(jié)研究:皮層注射Homer1a過表達(dá)載體、Homer1a基因敲除小鼠。

7、(7)蛋白組學(xué)：運用一維凝膠電泳結(jié)合非標(biāo)記定量蛋白組方法、Gene ontology(GO)和Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件的應(yīng)用；
　　實驗結(jié)果:
　　創(chuàng)傷性腦損傷可引起腦水腫和神經(jīng)功能失調(diào)；HE染色結(jié)果顯示，損傷后24小時小鼠皮層及海馬中神經(jīng)元細(xì)胞死亡數(shù)目明顯增加，神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生核固縮現(xiàn)象。TUNEL染色結(jié)果顯示 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目亦明顯增多。Western blot結(jié)果顯示，Ho

8、mer1a在創(chuàng)傷性腦損傷后出現(xiàn)表達(dá)升高，而Homer1b/c則未出現(xiàn)明顯變化，免疫熒光及免疫組化結(jié)果同上。通過認(rèn)知學(xué)及動物行為學(xué)方法（水迷宮、高架十字迷宮及曠場試驗），結(jié)果顯示，創(chuàng)傷性腦損傷可造成小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的損害，并產(chǎn)生嚴(yán)重的抑郁。蛋白組學(xué)結(jié)果，大量蛋白及信號通路參與創(chuàng)傷性腦損傷的過程，其中包括經(jīng)典的損傷標(biāo)記物GFAP及S100B等，還包括Homer家族分子(Homer1,Homer2及Homer1a)。
　　為進(jìn)一步研究，

9、我們使用了Homer1a基因敲除小鼠以及Homer1a過表達(dá)載體。通過上調(diào)Homer1a，可有效降低腦水腫的程度及神經(jīng)功能評分，在Homer1a基因敲除小鼠則會加重腦水腫的程度和神經(jīng)功能失調(diào)。Western blot結(jié)果顯示，腦損傷后24小時活化caspase-3的表達(dá)在野生型小鼠中明顯升高，Homer1a基因敲除后表達(dá)升高更加明顯，而上調(diào)Homer1a則降低腦損傷后活化caspase-3的表達(dá)。動物行為學(xué)結(jié)果顯示，上調(diào)Homer1a可

10、以在一定程度上逆轉(zhuǎn)腦損傷引起的學(xué)習(xí)記憶損害及焦慮情緒，而Homer1a基因敲除的作用相反。利用質(zhì)譜分析Homer1a基因敲除后蛋白組的變化，在檢測出的6529種蛋白中，237種蛋白表達(dá)差異在2倍以上，生物信息學(xué)軟件分析出泛素化信號通路, axonal guidance通路,蛋白激酶A通路, ERK/MAPK通路及Notch通路參與其中。通過功能疾病數(shù)據(jù)庫分析，Homer1a基因敲除可影響基底節(jié)細(xì)胞功能、突觸功能等。研究顯示，Homer1

11、a基因敲除后p-ERK,p-CREB和 NICD的表達(dá)升高，GluR1及GluR2/3的表達(dá)降低。
　　實驗結(jié)論:
　　實驗數(shù)據(jù)表明，Homer1a在創(chuàng)傷性腦損傷后具有神經(jīng)保護(hù)的功能，可有效降低TBI后腦水腫的程度及神經(jīng)功能評分，在一定程度上逆轉(zhuǎn)TBI引起的學(xué)習(xí)記憶損害及焦慮情緒，并抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡。Homer1a可參與多種信號通路及分子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮著重要的作用，特別是在泛素化信號通路, ERK/MAPK通路及Notch通路的