TLR4在創(chuàng)傷性腦損傷急性炎癥損傷中的作用機制及姜黃素的保護效應(yīng)研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)，是神經(jīng)外科常見的一種急重癥，其發(fā)生率無論平時還是戰(zhàn)時都非常高，死亡率及致殘率均高居各類創(chuàng)傷首位。除了原發(fā)性腦損傷引起的腦組織結(jié)構(gòu)破壞，包括神經(jīng)炎癥反應(yīng)、自由基堆積、興奮性氨基酸中毒、線粒體功能障礙、鈣超載等繼發(fā)性腦損傷顯著影響TBI神經(jīng)損傷程度。動物實驗研究表明神經(jīng)炎癥反應(yīng)在TBI急性期迅速發(fā)生，并能持續(xù)很長一段時間，在TBI繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮重要的雙刃劍作用。目前

2、大多數(shù)學(xué)者認為，腦損傷急性期過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)不利于神經(jīng)細胞尤其是神經(jīng)元的存活及修復(fù)，導(dǎo)致神經(jīng)細胞及組織損傷加重。因此對TBI急性期損傷腦區(qū)過度炎癥反應(yīng)的有效調(diào)控成為干預(yù)TBI神經(jīng)損傷的一條重要策略。
　　在單核巨噬細胞等外周循環(huán)中的免疫細胞通過遭受破壞的血腦屏障進入損傷腦組織引起神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)的同時，同屬于單核巨噬細胞系的神經(jīng)系統(tǒng)原位的免疫細胞——小膠質(zhì)細胞在損傷細胞釋放的多種內(nèi)源性刺激物的刺激下，出現(xiàn)阿米巴樣形態(tài)改變，可以吞

3、噬清除壞死的神經(jīng)細胞碎片，還可釋放多種炎癥因子、趨化因子等，廣泛參與誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫反應(yīng)。既往研究報道小膠質(zhì)細胞胞膜廣泛表達Toll樣受體(tolllike receptors，TLRs)。TLRs能識別細菌、病毒、真菌等表達的病原相關(guān)分子模式，引發(fā)固有免疫反應(yīng)，在病原體感染性疾病中發(fā)揮重要作用。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)TLRs還廣泛參與細胞損傷后產(chǎn)生釋放的蛋白、多肽、核酸等內(nèi)源性的危險相關(guān)分子模式(danger-associated mo

4、lecular pattern，DAMPs)的識別及免疫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動非感染性的固有免疫反應(yīng)。其中TLR4亞型是目前神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫研究的熱點，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括MyD88依賴和非依賴兩條途徑。在MyD88依賴的信號途徑中，TLR4接受的胞外信號通過MyD88分子經(jīng)下游的白介素-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor associated kinases，IRAK)、轉(zhuǎn)化生長因子β激酶1(transforming

5、 growth factor-β activated kinase1，TAK1)等分子向下進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起核因子-κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-κB，IκB)磷酸化降解，導(dǎo)致NF-κB(尤其是p65亞單位)從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核，啟動各類炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成，積極參與到神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)中。
　　祖國醫(yī)學(xué)博大精深，是醫(yī)學(xué)研究者取之不盡、用之不竭的巨大寶庫。其中，姜科姜黃屬植物姜黃是天然抗氧

6、化、抗炎中草藥，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)及印度醫(yī)學(xué)中已經(jīng)有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，姜黃素就是從其根莖提純出來的一種有效活性成分?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實姜黃素具有強大的抗炎作用，能促進炎癥損傷組織的修復(fù)。近年來已開始逐漸深入到各類神經(jīng)系統(tǒng)損傷的相關(guān)研究中，雖有零星報道觀察到姜黃素對TBI神經(jīng)損傷有明顯保護作用，但機制不清，尤其是姜黃素對TBI急性期神經(jīng)炎癥的調(diào)控作用及其可能調(diào)節(jié)機制存在大量未知。推測姜黃素的神經(jīng)炎癥調(diào)控作用可能通過影響小膠質(zhì)細胞的形態(tài)和功能來實

7、現(xiàn)。
　　基于此，本課題研究采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡、細胞共培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附檢測、FJB及TUNEL染色等技術(shù)方法，首先對比檢測了野生型和TLR4基因敲除(TLR4-/-)型小鼠TBI急性期24h時神經(jīng)功能及神經(jīng)元損傷情況，以及損傷腦組織炎癥因子含量，為明確TLR4調(diào)控TBI急性期神經(jīng)炎癥反應(yīng)進而影響神經(jīng)元死亡及神經(jīng)功能提供有利證據(jù);然后采取TBI后腹腔注射姜黃素處理，同樣觀察24h時神經(jīng)損傷及損傷區(qū)神經(jīng)炎癥的變化情況，以及T

8、LR4在膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達情況和TLR4通路信號分子的表達變化，揭示TLR4在姜黃素減輕TBI急性期過度神經(jīng)炎癥中的可能作用;最后利用體外原代小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元細胞共培養(yǎng)方式，予脂多糖及姜黃素處理，觀察小膠質(zhì)細胞的形態(tài)、胞膜TLR4表達、炎癥因子分泌的變化對神經(jīng)元細胞損傷的影響，以及小膠質(zhì)細胞TLR4通路信號分子的表達變化情況，證實姜黃素能通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞TLR4表達而抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化，進而減輕神經(jīng)元炎性損傷，并對其可能的信號通

9、路進行了初步研究，主要結(jié)果如下:
　　1.所有實驗小鼠于TBI后2h左右能完全蘇醒，清醒后其一般活動與進食行為均減弱。術(shù)后24h頭部切口愈合良，未發(fā)生感染現(xiàn)象及動物死亡，術(shù)后存活率達百分之百。
　　2.創(chuàng)傷側(cè)腦組織TLR4表達于TBI后6h可見明顯升高，后繼續(xù)逐漸升高直至24h達到頂峰。之后TLR4表達開始下降，于72h時TLR4表達仍顯著高于0h。
　　3.TBI后24h，野生型及TLR4-/-型小鼠神經(jīng)功能缺損及腦

10、水腫明顯，但TLR4-/-型小鼠的神經(jīng)功能評分及腦組織含水量顯著低于野生型。野生型及TLR4-/-型小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織可見大量TUNEL陽性、FJB陽性細胞，TLR4-/-小鼠TUNEL陽性細胞與DAPI陽性細胞之百分比、FJB陽性細胞數(shù)目均顯著低于野生型小鼠。
　　4.與各自假手術(shù)組比較，TBI后24h野生型及TLR4-/-型小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織中IL-1β、IL-6、MCP-1、RANTES等炎癥因子含量顯著增多，但TLR4-/

11、-組的各炎癥因子含量均顯著低于野生組。
　　5.TBI后15 min腹腔注射不同濃度的姜黃素，100mg/kg濃度姜黃素處理的小鼠創(chuàng)傷腦組織TLR4蛋白表達顯著低于未給藥組及50mg/kg濃度組。而200mg/kg濃度組的創(chuàng)傷腦組織TLR4蛋白表達也較未給藥組明顯降低，但與100mg/kg濃度組比較則無顯著差異。
　　6.TBI后24h，100mg/kg姜黃素處理組小鼠的神經(jīng)功能障礙評分及腦組織含水量顯著低于對照劑處理組。姜

12、黃素處理組小鼠TUNEL陽性細胞與DAPI陽性細胞之百分比、FJB陽性細胞數(shù)目均顯著低于對照劑處理組。
　　7.與各自假手術(shù)組比較，TBI后24h姜黃素處理組及對照劑處理組小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織中IL-1β、TNF-α、MCP-1、RANTES等炎癥因子含量顯著增多，但姜黃素處理組的各炎癥因子含量均顯著低于對照劑處理組。
　　8.TBI后24h，創(chuàng)傷后予對照劑或姜黃素處理組小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織均可見大量TLR4與CD11b陽性共表

13、達的小膠質(zhì)/巨噬細胞，同時TLR4免疫陽性強。而這些CD11b陽性細胞，胞體明顯變大，突起也變粗變短。但姜黃素處理組的TLR4陽性小膠質(zhì)/巨噬細胞數(shù)目顯著低于對照劑處理組。
　　9.與各自假手術(shù)組比較，創(chuàng)傷后予對照劑及姜黃素組小鼠創(chuàng)傷周圍腦組織TLR4、MyD88、p-Iκ B-α，NF-κB等蛋白表達明顯上調(diào)，但姜黃素處理組的TLR4、MyD88、p-IκB-α，NF-κB等蛋白表達均顯著低于對照劑組。而兩創(chuàng)傷組腦組織IκB-α

14、t的蛋白表達則較兩假手術(shù)組均明顯下調(diào)，但創(chuàng)傷后給予姜黃素組的腦組織Iκ B-α蛋白表達顯著高于給予對照劑組。
　　10.0.5μM，1μM，2μM及5μM濃度的姜黃素對元代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞活力無明顯影響，而10μM濃度姜黃素則顯著降低小膠質(zhì)細胞活性;而5μM及10μM濃度姜黃素均顯著降低原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞活性。故本部分實驗選擇最佳濃度2μM姜黃素對共培養(yǎng)細胞進行處理。
　　11.單獨神經(jīng)元培養(yǎng)中，脂多糖(LPS)刺激后神經(jīng)元

15、的胞體明顯變小，突起也大量減少，不能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);而經(jīng)姜黃素處理后，其形態(tài)破壞與對照劑處理組相比略有改善，但改善程度并不十分明顯。在神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，LPS刺激后神經(jīng)元的形態(tài)破壞程度較單培養(yǎng)組更嚴重;而予姜黃素處理后，共培養(yǎng)的神經(jīng)元形態(tài)破壞得以明顯改善。
　　12.單獨神經(jīng)元培養(yǎng)中，LPS刺激后神經(jīng)元的caspase3表達明顯上調(diào);而經(jīng)姜黃素處理后，caspase3表達無明顯差異。在神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，L

16、PS刺激后神經(jīng)元的caspase3表達較單培養(yǎng)組顯著增多;而予姜黃素處理后，共培養(yǎng)的神經(jīng)元caspase3表達則顯著下降。
　　13.經(jīng)LPS刺激后，可見大量TLR4與CD11b陽性共表達的小膠質(zhì)細胞，同時表達的TLR4免疫陽性較強，而這些小膠質(zhì)細胞與對照組相比，胞體明顯變大，突起也變粗變短;予姜黃素處理后，小膠質(zhì)細胞雖仍可見大量TLR4與CD11b共表達，但TLR4免疫熒光強度顯著降低，且細胞胞體變大及突起變短變粗的程度明顯緩解

17、。
　　14.LPS刺激共培養(yǎng)細胞，24h時IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、RANTES濃度顯著升高，經(jīng)姜黃素處理組的IL-Iβ、IL-6、RANTES濃度顯著低于對照劑處理組。
　　15.LPS刺激后小膠質(zhì)細胞內(nèi)TLR4及其下游分子MyD88、p-Iκ B-α，NF-κB等蛋白表達顯著上調(diào)，IκB-α的蛋白表達顯著下調(diào)，但姜黃素處理后的TLR4、MyD88、p-Iκ B-α，NF-κB等蛋白表達的上調(diào)程度顯著

18、降低，IκB-α蛋白表達的下調(diào)程度也顯著降低。
　　本課題初步闡明了急性期神經(jīng)炎癥反應(yīng)對TBI神經(jīng)損傷的影響，進一步揭示了TLR4對急性期神經(jīng)炎癥及神經(jīng)損傷的調(diào)控作用，為探索TBI治療的新藥物及靶點提供了重要依據(jù)。而且，本課題證明姜黃素（中草藥姜黃的有效成分提取物）對TBI急性期神經(jīng)損傷的改善作用至少部分是通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞TLR4信號通路抑制過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)的，拓展了姜黃素的治療范圍，也為深入探究姜黃素治療TBI的可能藥