S-equol經(jīng)由Akt-FOXO3a通路抑制前列腺癌生長的體內(nèi)外研究.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer)是男性生殖泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生在前列腺上皮的惡性腫瘤，主要包括腺癌、導(dǎo)管腺癌、腺鱗癌、鱗狀細胞癌、尿路上皮癌等幾種病理類型。據(jù)2012年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，該年在世界范圍內(nèi)有1，111，700例新增病例，使前列腺癌成為男性第二位常見的腫瘤。在1，111，700例病例中，發(fā)達國家的新增病例為758，700例，發(fā)展中國家的新增病例為353，000例。其中，歐洲、大洋洲、北美洲等地區(qū)的發(fā)達國家前列

2、腺癌的發(fā)病率是世界平均水平的25倍以上。前列腺癌的發(fā)病率除了在不同地區(qū)之間存在明顯差異，在不同種族之間也存在明顯差異。它在黑人中的發(fā)病率最高，白人的發(fā)病率次之，亞洲男性的發(fā)病率最低。雖然前列腺癌在南亞和東亞的發(fā)病率則低于歐美國家，但情況也不容樂觀。與發(fā)達國家相比，亞洲、東歐等地區(qū)的發(fā)展中國家的前列腺癌發(fā)病率也在逐年上升。在日本和中國，前列腺增生的發(fā)病率已經(jīng)接近西方國家。
　　前列腺癌在死亡率方面也不容樂觀。2012年全世界共有30

3、7，500人死于前列腺癌，占腫瘤總死亡率的3.75％，是男性腫瘤相關(guān)死亡因素的第五位。其中，發(fā)達國家的死亡人數(shù)為142，000，發(fā)展中國家的死亡人數(shù)為165，500。盡管發(fā)展中國家的發(fā)病率遠低于發(fā)達國家，但發(fā)展中國家與發(fā)達國家與的總死亡人數(shù)差異不大，這與發(fā)展中國家人口基數(shù)大有關(guān)，也與發(fā)展中國家的前列腺癌患者的死亡率明顯高于發(fā)達國家有關(guān)。
　　前列腺癌常用Gleason評分系統(tǒng)為其評分分級，其中2分為最低，10分為最高。臨床上根據(jù)評

4、分不同，對前列腺癌患者進行分期，進而采用不同的治療手段。如:手術(shù)切除、放射性治療、藥物化療、激素治療、聚焦超聲治療等。前列腺癌患者在經(jīng)歷一段時間的激素治療后，往往發(fā)展成激素難治療性前列腺癌(Hormone refractoryprostate cancer, HRPC)，病情進一步惡化，造成患者生活質(zhì)量下降，臨床結(jié)局差。如果在前列腺癌早期進行有效干預(yù)，將能有效改變患者的生活質(zhì)量甚至延長生存期。
　　流行病學(xué)研究顯示，亞洲前列腺癌的

5、低發(fā)病率可能與其豆類食物的高消費有關(guān)。大量研究表明，豆類食物中所含的大豆異黃酮等物質(zhì)具有抗腫瘤的作用。大豆甙元(Daidzein)是大豆異黃酮的一種，主要存在于大豆及其制品之中。大豆甙元被腸道中的糖苷水解酶水解之后，進一步被腸道菌群代謝成次級代謝產(chǎn)物-雌馬酚(Equol)。與其他的異黃酮相比，Equol在呋喃環(huán)C-3的位置有一個手性碳原子。因此，Equol存在S型與R型兩種旋光異構(gòu)體，然而至今在人體中只發(fā)現(xiàn)了S型雌馬酚(S-equol)

6、。并不是所有的人都具備將大豆甙元代謝成Equol的能力，這種代謝能力與不同個體的腸道菌群不同有關(guān)。它在不同國家、不同地區(qū)人群中是有差異的，我們將具有這種能力的人稱為“雌馬酚代謝者(Equol代謝者)”。在人群中，Equol代謝者大約有30％-50％，其中西方國家的Equol代謝者只有30％，遠低于亞洲國家，如在日本的Equol代謝者為58％，在中國的雌馬酚代謝者為60.4％。
　　Equol作為一種植物類雌激素，能與雌激素受體(e

7、strogen receptors，ER)結(jié)合。其中（±）Equol及S-equol與ER-β的結(jié)合能力強于與ER-α，而R-equol剛好相反，與ER-α具有更強的親和力。有研究提示，與其他黃酮類植物化合物相比，Equol具有更強的抗氧化性。Equol除了具有抗氧化能力以外，在抗腫瘤方面也有一定作用。在體外實驗中證明，Equol可以通過抑制MMP2，MMP9 mRNA的表達抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細胞中，Equol可以通過上調(diào)Ca

8、spase8的活性，激活外源性凋亡通路，又可以通過促進Cytochrome C的表達，激活下游Caspase，引起細胞內(nèi)源性凋亡。
　　叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3(Forkhead box O3，fox03a)基因編碼的蛋白也稱為FOXO3或FOXO3a。FOXO3a作為轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。近來，Shukla等報道FOXO3a在抑制前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。FOXO3a主要是通過上調(diào)細胞周期蛋白p21

9、、p27和凋亡相關(guān)蛋白Fasl、Bim的轉(zhuǎn)錄來抑制前列腺癌的生長。同時，F(xiàn)OXO3a又可以被蛋白激酶AKT、ERK、IKK等負調(diào)控。它們通過磷酸化FOXO3a的T32、S253和S315三個位點后，促使FOXO3a由細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，然后被E3泛素化酶MDM2降解。
　　蛋白激酶B(PKB)是絲氨酸和蘇氨酸的特異性激酶，又被稱作AKT。
　　它在細胞中的糖代謝、凋亡、增殖、遷移等過程都扮演著重要的角色。AKT通過與膜上磷

10、脂酰肌醇三磷酸(PI3K)以正確的方式結(jié)合以后，可以被PDPK1和mTORC2分別磷酸化Thr308和Ser473位點，激活A(yù)KT的活性，使其能調(diào)控下游蛋白磷酸化的表達，進而發(fā)揮其功能。有研究顯示，AKT可以磷酸化FOXO3a，從而調(diào)節(jié)FOXO3a的轉(zhuǎn)錄活性。
　　本研究通過體外實驗，研究S-equol是否直接影響前列腺癌細胞的生長，以及其效應(yīng)是否與AKT/FOXO3a通路有關(guān)。同時，在裸鼠移植瘤模型中研究了S-equol對前列腺

11、癌的作用，為S-equol進一步作為治療或者輔助治療前列腺癌的候選藥物奠定基礎(chǔ)。
　　實驗方法:
　　1.采用MTT法，觀察S-equol對前列腺癌細胞PC3，DU145，LnCaP,及正常前列腺上皮細胞RWPE-1生長的抑制作用;
　　2.采用流式細胞儀，觀察S-equol對前列腺癌細胞的細胞周期和細胞凋亡的影響;
　　3.采用免疫熒光細胞化學(xué)法，觀察S-equol對前列腺癌PC3細胞中FOXO3a蛋白核定位的

12、影響;
　　4.采用蛋白免疫印跡法，觀察S-equol對前列腺癌PC3細胞中總AKT、p-AKT以及總FOXO3a、 p-FOXO3a蛋白表達的影響。同時觀察FOXO3a下游相關(guān)分子p21，p27，Bim，F(xiàn)asl蛋白表達的變化;
　　5.采用PI3K/AKT抑制劑Wortmannin抑制p-AKT蛋白的表達后，觀察S-equol對前列腺癌PC3細胞周期、凋亡、FOXO3a蛋白核定位以及相關(guān)蛋白的影響;
　　6.采用裸

13、鼠移植瘤模型，觀察S-equol在體內(nèi)實驗中對前列腺癌生長的作用。
　　實驗結(jié)果:
　　1.S-equol能抑制前列腺癌細胞生長，對前列腺癌細胞LnCaP，DU145和PC3的半數(shù)致死濃度(IC50)分別為:169.13μM、139.50μM和119.20μM。在相同濃度下，并不影響正常的正常前列腺上皮細胞RWPE-1的生長。
　　2.200μM S-equol能誘導(dǎo)前列腺癌細胞發(fā)生凋亡，其細胞凋亡百分比和凋亡指數(shù)分別

14、為，LnCaP細胞:36.55±15.34％和188.4±21.2;DU145細胞:10.77±0.14％和154.96±5.63,PC3細胞:14.31±0.64％和329.7±12.5。
　　3.50-150μM S-equol阻滯前列腺癌細胞周期，將LnCaP和DU145細胞阻滯在G0/G1期，將PC3細胞阻滯在G2期。
　　4.100μM S-equol下調(diào)前列腺癌LnCaP，DU145和PC3細胞中MDM2蛋白的表

15、達，上調(diào)DU145和PC3細胞中FOXO3a蛋白的表達，對LnCaP細胞的FOXO3a蛋白表達上調(diào)不明顯。
　　5.100μM S-equol能抑制FOXO3a蛋白核轉(zhuǎn)出，使更多的FOXO3a蛋白聚集在細胞核內(nèi)。
　　6.S-equol對PC細胞中FOXO3a蛋白的上調(diào)和p-FOXO3 aT32的下調(diào)具有劑量依賴，同時上調(diào)FOXO3a相關(guān)下游p21，p27，Bim，F(xiàn)asl蛋白的表達;S-equol下調(diào)p-AKTser473

16、和p-AKThr308蛋白的表達，同時對AKT總蛋白的表達影響不大。
　　7.Akt抑制劑-Wortmannin抑制p-Akt蛋白表達后，S-equol能進一步上調(diào)FOXO3a及其相關(guān)下游p21，p27，Bim，F(xiàn)asl蛋白的表達，并抑制FOXO3aT32蛋白的表達。
　　8.Wortmannin抑制p-AKT蛋白表達后，S-equol能誘導(dǎo)更多的細胞凋亡:Wortmannin組，100μM S-equol和Wortmann

17、in+100μM S-equol組的凋亡指數(shù)分別為:108.4％、140.1％和389.9％。阻滯更多的PC3細胞在G2期:DMSO組:4.18±0.59％;Wortmannin組:4.95±1.11％;100μM S-equol組:22.82±0.32％; Wortmannin+100μMS-equol組:26.16±0.50。Wortmannin聯(lián)合S-equol處理，使更多的FOXO3a蛋白聚集在細胞核內(nèi)。
　　9.S-eq