LncRNA在椎間盤退變過程中調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　椎間盤的老化和退變是脊柱退變性疾病發(fā)生的前提條件和病理基礎(chǔ)，理解椎間盤老化和退變的生物學(xué)機(jī)制，開發(fā)有效的治療干預(yù)措施以應(yīng)對椎間盤退變帶來的健康問題已經(jīng)成為當(dāng)前和未來全球性醫(yī)學(xué)難題之一。本研究通過生物信息學(xué)分析篩選髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)的lncRNA，進(jìn)而探索lncRNA在椎間盤退變過程中髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控的分子機(jī)制，從而為尋找椎間盤退變性疾病治療的新靶點(diǎn)提供科學(xué)指導(dǎo)。
　　方法：
　　1、比較三種生物信息學(xué)分析

2、軟件，應(yīng)用TargetScan軟件篩選可能通過miR-155參與髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控的lncRNA。2、RT-PCR檢測髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155mimics后lncRNA表達(dá)調(diào)控情況，通過lncRNA及mRNA芯片檢測評估髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155過表達(dá)慢病毒后lncRNA及mRNA表達(dá)譜變化，評估m(xù)iR-155作為基因治療靶點(diǎn)可能對髓核細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響。3、流式細(xì)胞分析檢測過表達(dá)GAS5 lncRNA后髓核細(xì)胞的凋亡情況，Wester

3、n Blot檢測線粒體通路上兩個(gè)關(guān)鍵凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)，驗(yàn)證GAS5 lncRNA對髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控的影響，探索GAS lncRNA參與髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、退變椎間盤髓核組織內(nèi)共有631個(gè)表達(dá)上調(diào)的lncRNA序列信息較為明確，其中有148個(gè)上調(diào)的lncRNA包含了178個(gè)hsa-miR-155-5p結(jié)合位點(diǎn)。符合TargetScan評分標(biāo)準(zhǔn)的lncRNA有16個(gè)，

4、NR_002819含有6個(gè)hsa-miR-155-5p結(jié)合位點(diǎn)，ENST00000511037、NR_027451包含了5個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，19個(gè)lncRNA包含了2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，126個(gè)lncRNA包含了1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。2、GAS5 lncRNA包含了1個(gè)hsa-miR-155-5p結(jié)合位點(diǎn)，外源性導(dǎo)入hsa-miR-155 mimics72小時(shí)后，髓核細(xì)胞GAS5 lncRNA表達(dá)較陰性對照組明顯下降（P＜0.05）。lncRNA及mRNA表

5、達(dá)譜芯片分析共發(fā)現(xiàn)721個(gè)差異表達(dá)lncRNA（Fc值≥2，P＜0.05），其中492個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)，229個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)。芯片檢測的18個(gè)GAS5 lncRNA轉(zhuǎn)錄本均表達(dá)下調(diào)，僅有GAS5-021表達(dá)具有顯著差異（Fc值≥1.5，P＜0.05）。Gene Ontology分析顯示，髓核細(xì)胞在miR-155過表達(dá)后基因表達(dá)發(fā)生了明顯的改變，主要集中在腫瘤、免疫性疾病、退變性疾病及心血管疾病等領(lǐng)域，其中以強(qiáng)直性脊柱炎及滑

6、膜炎與椎間盤的關(guān)系最為密切。3、GAS5 lncRNA過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染96小時(shí)后，髓核細(xì)胞GAS5 lncRNA的表達(dá)水平提高(P＜0.05)，凋亡蛋白酶Caspase-3表達(dá)上調(diào)，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，髓核細(xì)胞的凋亡率較陰性對照組明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　lncRNA在退變椎間盤髓核細(xì)胞凋亡調(diào)控中起到了重要作用，GAS5 lncRNA過表達(dá)使得髓核細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡通路上的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白家族成員的表