雞PGCs生成過(guò)程中C1EIP基因調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、生殖細(xì)胞可以把生物的遺傳信息傳遞給下一代，維持生命的傳遞，對(duì)生殖細(xì)胞分化研究具有重要意義。原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells，PGCs)是所有生殖細(xì)胞的始祖細(xì)胞，能夠在性腺中分化為精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)或卵原干細(xì)胞(Ovary stem cells，OSCs)，進(jìn)而進(jìn)一步發(fā)育分化為精子或卵子。PGCs的發(fā)生受到許多內(nèi)源性調(diào)控因子和細(xì)胞外基質(zhì)等外源因素的調(diào)控，這些因

2、子通過(guò)不同的信號(hào)通路，構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，直接或間接地調(diào)控PGCs的形成。目前，研究者們通過(guò)體外分離培養(yǎng)、體外誘導(dǎo)、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞等方多種方式對(duì)PGCs的生長(zhǎng)和分化進(jìn)行了大量的研究，然而關(guān)于調(diào)控PGCs發(fā)生過(guò)程的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制卻知之甚少，因此PGCs發(fā)生過(guò)程機(jī)制的探究成為近年來(lái)備受關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　隨著PGCs研究的深入，研究者們已經(jīng)探究發(fā)現(xiàn)存在一些關(guān)鍵性的基因、信號(hào)通路、生長(zhǎng)因子以及表觀遺傳修飾因素在此過(guò)程中起到重要的調(diào)控

3、作用，隨著這些因素對(duì)于PGCs發(fā)生起到了一定的促進(jìn)作用，但是并沒(méi)有真正從意義上提供提高PGCs生成效率，進(jìn)而無(wú)法滿足相關(guān)的科研需求，因此亟需對(duì)從新的領(lǐng)域?qū)GCs的生成機(jī)制進(jìn)行創(chuàng)新性地探究，深入了解和認(rèn)識(shí)PGCs的產(chǎn)生過(guò)程，從而獲取大量的PGCs。
　　為了進(jìn)一步探究調(diào)控PGCs發(fā)生及分化的作用機(jī)制，從根本上解決PGCs生成效率低下的問(wèn)題，本研究基于本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)雞胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)、

4、PGCs和SSCs的RNA-Seq測(cè)序結(jié)果中篩選到PGCs特異表達(dá)的新基因LOC418414（Genbank登錄號(hào):XM_416629.3）的基礎(chǔ)上，根據(jù)其表達(dá)位置命名為C1EIP，對(duì)其在雞ESCs向PGCs分化過(guò)程中從體內(nèi)和體外兩個(gè)水平上進(jìn)行系統(tǒng)的功能和機(jī)制驗(yàn)證，深入了解家雞ESCs向PGCs分化過(guò)程的調(diào)控機(jī)制，為有效提高ESCs向PGCs誘導(dǎo)分化效率提供理論依據(jù)和參考，并且為雞ESCs向PGCs分化其他類(lèi)似關(guān)鍵功能基因的功能及機(jī)制研

5、究提供理論基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果如下:
　　1.為了有效確定候選特異基因C1EIP在的生物功能以及其真核細(xì)胞中的定位，為后期功能及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，對(duì)C1EIP進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示，C1EIP主要與鳥(niǎo)類(lèi)同源性較高，但同源蛋白為未知蛋白，未發(fā)現(xiàn)特異的結(jié)構(gòu)域。我們結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的C1EIP編碼序列，利用RT-PCR擴(kuò)增C1EIP編碼區(qū)，分別構(gòu)建重組表達(dá)載體pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP。以pEGFP

6、-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，確定C1EIP的定位，并以RT-PCR和Western Blot檢測(cè)C1EIP在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯的情況;同時(shí)以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP載體，肌肉注射小鼠后采血制備抗小鼠血清，以IFA和Western Blot檢測(cè)抗體效價(jià)。酶切及測(cè)序結(jié)果均顯示pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP載體構(gòu)建成功。pEGFP-C1EIP轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞后，C1EIP表達(dá)于

7、細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明C1EIP定位于細(xì)胞質(zhì)中，且能夠啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄和翻譯;以1μg∶1.5μg的比例將PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP產(chǎn)物注射小鼠肌肉制備抗小鼠血清，IFA檢測(cè)最佳效價(jià)為1∶25，并以此效價(jià)進(jìn)行Westen Blot檢測(cè)顯示能夠識(shí)別到C1EIP蛋白。
　　2.為了探究C1EIP在雞PGCs生成過(guò)程中生物學(xué)功能探究，我們針對(duì)C1EIP編碼區(qū)設(shè)計(jì)3個(gè)shRNA靶位點(diǎn)和1個(gè)陰性對(duì)照位點(diǎn)，構(gòu)建慢病毒干擾載體，并進(jìn)行慢病毒包裹，以

8、qRT-PCR檢測(cè)慢病毒干擾載體的干擾效率。在體外，以慢病毒干擾載體和過(guò)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染2代ESCs細(xì)胞，結(jié)合RA誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，觀察ESCs形態(tài)變化，并以qRT-PCR、細(xì)胞免疫化學(xué)和流式細(xì)胞分析檢測(cè)PGCs生成效率;在體內(nèi)，以慢病毒RNA干擾載體侵染雞胚，摸索出最佳的侵染效率，侵染后的雞胚以qRT-PCR、PAS切片染色、免疫組化以及流式細(xì)胞分析等方法檢測(cè)PGCs生成效率。結(jié)果顯示成功構(gòu)建慢病毒干擾載體C1EIP-sh1、C1EIP-s

9、h2和C1EIP-sh3，干擾效率分別為80.39％、87.80％和38.36％。在體外，正常RA誘導(dǎo)在第2d出現(xiàn)小類(lèi)胚體（Embryoid Body，EB），在第4d時(shí)類(lèi)胚體增多、變大，第6d類(lèi)胚體的邊緣開(kāi)始出現(xiàn)裂口，并且伴隨有少量的細(xì)胞從類(lèi)胚體內(nèi)部釋放，第8d時(shí)類(lèi)胚體嚴(yán)重破裂，大量細(xì)胞釋放，在第10-12d類(lèi)胚體基本上裂解完全，出現(xiàn)類(lèi)精原干細(xì)胞（Spermatogonial stem cells-like，SSCs-like），并聚

10、團(tuán)成葡萄串狀克隆;過(guò)表達(dá)組中，在第2d出現(xiàn)大的類(lèi)胚體，第4d類(lèi)胚體邊緣開(kāi)始出現(xiàn)小缺口，第6d類(lèi)胚體大部分破裂并釋放大量?jī)?nèi)部細(xì)胞，第8d出現(xiàn)類(lèi)SSCs細(xì)胞，第10-12d出現(xiàn)典型的呈葡萄串狀的SSCs克隆;在敲低中，第2-6d細(xì)胞未出現(xiàn)類(lèi)胚體，第8d開(kāi)始出現(xiàn)小的類(lèi)胚體，然而培養(yǎng)至12d類(lèi)胚體的數(shù)量、大小以及形態(tài)并未出現(xiàn)明顯的變化;qRT-PCR結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)C1EIP后，全能性基因sox2表達(dá)量總體上由1.00±0.04持續(xù)降低至0.14

11、±0.01，而cvh、c-kit、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1表達(dá)量自始至終都逐步上升至2.14±0.03、2.79±0.05、2.26±0.06、2.73±0.03和2.59±0.05，目的基因C1EIP表達(dá)量在第4d上升至3.99±0.06，在第12d時(shí)由下降至2.87±0.07;敲低C1EIP后，sox2表達(dá)量在第0-12d中沒(méi)有顯著的變化，cvh、c-kit和C1EIP表達(dá)量分別由1.00±0

12、.02、1.00±0.01和1.00±0.02穩(wěn)定持續(xù)下降至0.55±0.01、0.70±0.01和2.87±0.07，Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1表達(dá)量由1.00±0.04、1.00±0.04、1.00±0.03和1.00±0.04分別先下降至0.53±0.04、0.45±0.05、0.86±0.03和0.76±0.02，然后再略微上升至0.59±0.01、0.80±0.04、0.88±0.04、0

13、.93±0.08;細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示相對(duì)于RA誘導(dǎo)組，過(guò)表達(dá)組顯著增加CVH和C-KIT的表達(dá)，而敲低組抑制CVH和C-KIT的表達(dá)。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，RA誘導(dǎo)組中CVH+細(xì)胞比例為3.4％，在過(guò)表達(dá)C1EIP后，CVH+細(xì)胞比例顯著上調(diào)至4.6％，然而敲低C1EIP使得CVH+細(xì)胞降低至2.9％。在體內(nèi)，雞胚注射慢病毒載體的最佳條件為鈍端注射10μL106TU/mL慢病毒干擾載體+90μL DMEM，注射后能夠穩(wěn)定表達(dá)egfp且

14、雞胚能夠激發(fā)綠色熒光。qRT-PCR結(jié)果顯示各個(gè)基因的表達(dá)量在Blank組和sh-Ctrl組之間沒(méi)有顯著的變化，而在敲低C1EIP后，全能性基因sox2的表達(dá)量下降趨勢(shì)相對(duì)于其他分組有所減緩，而cvh、c-kit、stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖相關(guān)基因以及目的基因C1EIP的大幅度下降到0.20±0.07、0.43±0.08、0.45±0.06、0.51±0.07、0.35±0.07、0.46±0

15、.04和0.22±0.03; PAS結(jié)果顯示敲低C1EIP能夠顯著降低PGCs的產(chǎn)生。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示空白組和陰性對(duì)照組中生殖嵴中高度表達(dá)CVH和C-KIT，且表達(dá)部位幾乎充滿整個(gè)生殖嵴中，然而在敲低組中，CVH和C-KIT蛋白表達(dá)明顯降低，并且表達(dá)的部位僅僅局限于生殖嵴的邊緣部分。流式細(xì)胞分選結(jié)果顯示，相對(duì)于空白組和對(duì)照組（4.6％和4.3％），敲低C1EIP使得CVH標(biāo)記的PGCs比例明顯下調(diào)至3.1％。
　　3.為了系統(tǒng)

16、有效地闡明C1EIP表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制，我們結(jié)合NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢C1EIP轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游啟動(dòng)子2000bp左右的序列，擴(kuò)增C1EIP啟動(dòng)子長(zhǎng)片段，克隆至pEGFP-N1載體中，置換CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建重組表達(dá)載體pC1 EIP-EGFP，轉(zhuǎn)染至DF1細(xì)胞中檢測(cè)C1EIP啟動(dòng)子長(zhǎng)片段的啟動(dòng)活性;通過(guò)缺失片段克隆技術(shù)，構(gòu)建C1EIP啟動(dòng)子不同缺失片段載體PGL3-P1～PGL3-P10，轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞后以雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

17、檢測(cè)各個(gè)缺失片段的啟動(dòng)子活性，篩查出C1EIP啟動(dòng)子核心調(diào)控區(qū)域;在此區(qū)域以生物信息學(xué)預(yù)測(cè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行定點(diǎn)缺失，構(gòu)建缺失載體，同樣以雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失對(duì)啟動(dòng)子活性的影響;最后分別10μmol/L、1μmol/L和4mmol/L的5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Azadc)、Trichostatin A(TSA)和valproic acid(VPA)處理，

18、檢測(cè)DNA甲基化和組蛋白乙?；瘜?duì)C1EIP啟動(dòng)子活性以及C1EIP在ESCs、PGCs和SSCs中表達(dá)變化的影響。酶切及測(cè)序結(jié)果均表明pC1EIP-EGFP構(gòu)建正確，轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞后能夠激發(fā)綠色熒光，定性地說(shuō)明擴(kuò)增的C1EIP啟動(dòng)子長(zhǎng)片段具有啟動(dòng)活性;同時(shí)啟動(dòng)子各個(gè)缺失片段載體酶切和測(cè)序結(jié)果也表明載體構(gòu)建成功，雙熒光素酶檢測(cè)啟動(dòng)子活性結(jié)果顯示P4-P6間，即-1025～-912bp為C1EIP啟動(dòng)子的核心活性區(qū)域;在此區(qū)域內(nèi)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因

19、子結(jié)合位點(diǎn)包括MEIS1、MAFG∷NFE2L1、STAT3、HLTF和Hand1∷Tcf3，其中只有STAT3起到正向調(diào)控作用;最后發(fā)現(xiàn)在DNA甲基化抑制5-Azadc以及組蛋白乙?；种苿㏕SA和VPA處理后，C1EIP啟動(dòng)子活性由10.82±0.54上升至18.49±0.72、33.27±0.83和38.11±0.53，同時(shí)5-Azadc、 TSA和VPA處理后，C1EIP在雞ESCs、PGCs和SSCs中表達(dá)量分別由1.00±0

20、.23、5.73±0.54、0.94±0.23變化為1.43±0.42、10.60±0.26、2.83±0.18和2.64±0.23、9.89±0.37、3.25±0.16以及2.99±0.43、8.33±0.56、2.94±0.29。
　　4.為了探究C1EIP調(diào)控PGCs生成的機(jī)制，我們通過(guò)構(gòu)建C1EIP原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)其在大腸桿菌中表達(dá)，以GST pull-down挖掘C1EIP互作蛋白，構(gòu)建融合表達(dá)載體pcDNA3.0-

21、ENO1-HA，以體外免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證ENO-HA和C1EIP-EGFP間互作關(guān)系。結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫(kù)，以生物信息學(xué)分析技術(shù)探究互作基因ENO1的關(guān)聯(lián)基因，以qRT-PCR驗(yàn)證其在PGCs生成過(guò)程中的表達(dá)變化情況。通過(guò)構(gòu)建Myc啟動(dòng)子的雙熒光素酶報(bào)告載體PGL3-Myc-pro以及重組表達(dá)載體pcDNA3.0-MBP-1，同時(shí)為了消除同源家族基因的干擾，我們還構(gòu)建了ENO2的重組表達(dá)載體pcDNA3.0-ENO2，結(jié)合之前構(gòu)建完成的pcD

22、NA3.0-ENO1-HA載體，共轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，以雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)Myc啟動(dòng)子活性變化情況，并根據(jù)所得結(jié)果和查找相關(guān)文獻(xiàn)，繪制出C1EIP和ENO1/MBP-1互作介導(dǎo)Notch信號(hào)通路調(diào)控PGCs生成的模式圖。GST pull-down結(jié)果顯示C1EIP與ENO1之間存在互作，且體外免疫共沉淀驗(yàn)證C1EIP之與ENO1間的互作關(guān)系。通過(guò)Uniport和PSORTⅡ數(shù)據(jù)庫(kù)以及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)ENO1定位于細(xì)胞質(zhì)中，與Myc相互

23、關(guān)聯(lián)，Myc下游基因?yàn)镹otch1。qRT-PCR結(jié)果顯示C1EIP和ENO1在雞ESCs向SSCs分化過(guò)程中表達(dá)趨勢(shì)保持一致，并且與Myc和Notch1表達(dá)趨勢(shì)相反。酶切和測(cè)序結(jié)果顯示雙熒光素酶報(bào)告載體PGL3-Myc-pro以及重組表達(dá)載體pcDNA3.0-MBP-1和pcDNA3.0-ENO2均構(gòu)建成功，且雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示MBP-1對(duì)Myc啟動(dòng)子活性存在抑制作用，而ENO1和ENO2對(duì)其沒(méi)有影響。最后根據(jù)以上結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)