去泛素化酶復(fù)合體USP1-UAF1在抗病毒固有免疫反應(yīng)中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)及維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-likereceptors，RLRs)等識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecularpatterns，PAMPs)后，可通過(guò)募集多種不同接頭分子，激活TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase1，TBK1)?；罨腡BK1磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interfe

2、ron regulatory3，IRF3)，促進(jìn)其二聚化及核內(nèi)轉(zhuǎn)位，進(jìn)而形成有活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，啟動(dòng)Ⅰ型干擾素(IFNα/β)基因轉(zhuǎn)錄。Ⅰ型干擾素可與Ⅰ型干擾素受體結(jié)合，通過(guò)JAK-STAT通路，誘導(dǎo)多種抗病毒基因的表達(dá)。因此，TBK1作為Ⅰ型干擾素產(chǎn)生所必需的關(guān)鍵激酶，其適度活化對(duì)機(jī)體抗病毒免疫及維持免疫穩(wěn)態(tài)均非常重要。已有報(bào)道，多個(gè)E3泛素連接酶可通過(guò)促進(jìn)TBK1泛素化，調(diào)控TBK1表達(dá)及活化;然而去泛素化酶及其介導(dǎo)的去泛素化，對(duì)T

3、BK1表達(dá)及活化的影響尚不清楚。泛素特異性蛋白酶1(ubiquitin specific peptidase，USP1)是泛素特異性蛋白酶家族中的一員，能夠去除一系列底物的泛素化修飾，進(jìn)而參與調(diào)控多種信號(hào)通路。USP1可與USP1相關(guān)因子1(USP1-associated factor1，UAF1)結(jié)合形成一個(gè)去泛素化酶復(fù)合體，并顯著增強(qiáng)USP1的去泛素化酶活性。USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體通過(guò)去除其靶分子的泛素化修飾，參與多個(gè)信

4、號(hào)通路的調(diào)控，如調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)過(guò)程和腫瘤發(fā)生過(guò)程等。然而，USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體在免疫系統(tǒng)，特別是固有抗病毒免疫反應(yīng)中的作用，尚不清楚。
　　本研究中，我們發(fā)現(xiàn)病毒感染可誘導(dǎo)USP1和UAF1的表達(dá);USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體可抑制TLR3/4和RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IRF3活化以及后續(xù)的IFN-β的分泌。USP1、UAF1均可特異性結(jié)合TBK1，并去除其K48位偶聯(lián)的泛素化修飾，進(jìn)而穩(wěn)定TBK1的蛋白表達(dá)。同時(shí)

5、，USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體的特異性抑制劑ML323，可抑制TBK1蛋白表達(dá)及IFN-β分泌。小鼠病毒感染模型中，ML323處理抑制抗病毒固有免疫反應(yīng)，并促進(jìn)病毒復(fù)制。本研究為T(mén)BK1活化提出了新的調(diào)控機(jī)制;USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體可能作為潛在靶點(diǎn)，用于病毒感染性疾病等的防治。
　　材料和方法：
　　1.USP1-UAF1對(duì)IFN-β表達(dá)的影響
　　1.1.USP1-UAF1特異性抑制劑ML323不同

6、濃度(0，15，30，60μM)預(yù)處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞4h后，仙臺(tái)病毒(Sendai virus，SeV)感染12h，ELISA檢測(cè)IFN-β的分泌情況。
　　1.2.設(shè)計(jì)合成分別針對(duì)USP1、UAF1的特異性干擾RNA(siRNA)，使用脂質(zhì)體Interferin將siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，36h后，分別用LPS、poly(I∶C)刺激或SeV感染細(xì)胞，ELISA檢測(cè)IFN-β、TNF-α及IL-6的分泌情況。<

7、br>　　1.3.構(gòu)建USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒，使用脂質(zhì)體JetPEI將USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒及相關(guān)報(bào)告基因質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞;24h后，分別用LPS、poly(I∶C)刺激或SeV感染細(xì)胞，報(bào)告基因檢測(cè)IFN-β及NF-κB報(bào)告基因活化情況。
　　1.4.分別用SeV感染或IFN-β刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞不同時(shí)間，Western blot檢測(cè)USP1和UAF1的表達(dá)變化。
　　2.USP1-UAF1

8、對(duì)IRF3活化的影響
　　2.1.利用脂質(zhì)體JetPEI將分別USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒及不同接頭分子，與IRF3或NF-κB報(bào)告基因質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞。報(bào)告基因檢測(cè)由TRIF、TBK1介導(dǎo)的IRF3報(bào)告基因活化情況，以及由Myd88、TRIF、RIG-Ⅰ介導(dǎo)的NF-κB報(bào)告基因活化情況。
　　2.2.利用脂質(zhì)體Interferin分別將USP1、UAF1 siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞;36h后，分別用

9、LPS刺激或SeV感染細(xì)胞;Western blot檢測(cè)IRF3及STAT1的磷酸化變化。
　　3.USP1-UAF1與TBK1的相互作用
　　3.1.利用脂質(zhì)體JetPEI將USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒及不同接頭分子，與IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞;報(bào)告基因檢測(cè)由RIG-I、MDA5、MAVS、TRlF、TBK1、IRF3-5D介導(dǎo)的IFN-β報(bào)告基因活化情況。將USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒及TBK1，分

10、別與IRF3、ISRE或NF-κB報(bào)告基因質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞;報(bào)告基因檢測(cè)由TBK1介導(dǎo)的IRF3、ISRE、NF-κB報(bào)告基因活化情況。
　　3.2.LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，Western Blot檢測(cè)USP1、UAF1的表達(dá)情況及USP1細(xì)胞內(nèi)定位變化。
　　3.3.利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將USP1或UAF1表達(dá)質(zhì)粒同多個(gè)接頭分子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中，

11、培養(yǎng)24h后，利用免疫共沉淀結(jié)合WesternBlot檢測(cè)USP1、UAF1與TLR/RLR信號(hào)通路中的不同分子的結(jié)合情況。
　　3.4.LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，利用免疫共沉淀結(jié)合WesternBlot檢測(cè)USP1、UAF1與TBK1、IRF3等分子的內(nèi)源性結(jié)合情況。
　　4.USP1-UAF1對(duì)TBK1泛素化及蛋白表達(dá)的影響
　　4.1.利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將TBK1、Ub或

12、K48-Ub表達(dá)質(zhì)粒，分別與USP1野生型質(zhì)粒、USP1去泛素化酶功能缺失突變體USP1-C90S或UAF1表達(dá)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，利用免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測(cè)USP1、USP1 C90S、UAF1對(duì)TBK1泛素化的影響。
　　4.2.利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別將不同劑量的USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后，Western Blot

13、檢測(cè)不同劑量USP1、UAF1對(duì)TBK1及IRF3蛋白表達(dá)的影響。
　　4.3.USP1-UAF1特異性抑制劑ML323預(yù)處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞4h后，LPS刺激不同時(shí)間點(diǎn)，Western Blot檢測(cè)TBK1的表達(dá)情況。
　　4.4.利用脂質(zhì)體Interferin分別將USP1、UAFl siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞;36h后，分別用LPS刺激或SeV感染細(xì)胞，Westem Blot檢測(cè)TBK1表達(dá)情況。

14、　　4.5.ML323預(yù)處理小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，LPS刺激4小時(shí)后，蛋白合成酶抑制劑CHX作用不同時(shí)間點(diǎn)，Western Blot檢測(cè)TBK1的表達(dá)情況。
　　5.USP1-UAF1復(fù)合體在體內(nèi)和體外情況下對(duì)病毒誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的調(diào)控
　　5.1.ML323處理小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，ELISA檢測(cè)病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-β;RT-PCR檢測(cè)IFN-β和下游響應(yīng)基因mRNA水平，以及細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制情況。
　　5.2

15、.C57BL/6(雄性，8周)小鼠腹腔注射淀粉誘導(dǎo)腹腔原代巨噬細(xì)胞。三天后利用DMSO或ML323處理，隨后VSV病毒感染小鼠12小時(shí)。ELISA檢測(cè)小鼠腹腔滲出液中IFN-β的含量;
　　5.3.C57BL/6(雄性，8周)小鼠腹腔注射ML323(10mg/kg)，4小時(shí)后再腹腔注射水胞性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)。8小時(shí)取外周血，ELISA檢測(cè)血清中IFN-β的含量;RT-PCR檢

16、測(cè)肝、肺、脾組織中IFN-β的mRNA水平和VSV病毒復(fù)制情況。
　　5.4.C57BL/6(雄性，8周)小鼠腹腔注射DMSO或ML323(10mg/kg)預(yù)處理，接著腹腔注射水胞性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)。18小時(shí)取肺組織進(jìn)行石蠟包埋切片進(jìn)行H&E染色。
　　研究結(jié)果：
　　1.USP1-UAF1增強(qiáng)IFN-β的表達(dá)
　　ML323可以顯著降低由SeV介導(dǎo)的小鼠腹

17、腔巨噬細(xì)胞IFN-β的分泌，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性;利用USP1、UAF1 siRNA處理明顯降低小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中LPS、poly(I∶C)、SeV誘導(dǎo)的IFN-β分泌。USP1、UAF1過(guò)表達(dá)可顯著提高RAW267.4細(xì)胞中LPS、poly(I;C)、SeV介導(dǎo)的IFN-β報(bào)告基因活性，但對(duì)NF-κB報(bào)告基因活性沒(méi)有明顯影響。
　　2.USP1-UAF1增強(qiáng)IRF3的活化
　　USP1、UAF1高表達(dá)均可顯著增強(qiáng)由T

18、RIF、TBK1介導(dǎo)的IRF3報(bào)告基因活性，但是對(duì)于MyD88、TRIF、RIG-I介導(dǎo)的NF-κB報(bào)告基因活性沒(méi)有明顯影響;USP1、UAF1基因沉默顯著降低小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中LPS、SeV介導(dǎo)的IRF3及STAT1的磷酸化。
　　3.USP1-UAF1與TBK1結(jié)合
　　TBK1與USP1或UAF1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)TBK1與USP1、UAF1均可結(jié)合。小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞中，TBK1可與U

19、SP1和UAF1內(nèi)源性結(jié)合;TBK1與USP12和USP46均不結(jié)合。
　　4.USP1-UAF1去除TBK1的K48位偶聯(lián)泛素化，穩(wěn)定其表達(dá)
　　USP1、UAF1均可顯著降低TBK1泛素化及K48位偶聯(lián)的泛素化修飾;USP1、UAF1高表達(dá)可以顯著增加HEK293T細(xì)胞中TBK1的蛋白表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)現(xiàn)象;USP1、UAF1基因沉默后，小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中TBK1蛋白表達(dá)明顯下降;加入CHX后ML323處理組細(xì)胞內(nèi)

20、的TBK1含量明顯低于對(duì)照組。
　　5.ML323增強(qiáng)固有抗病毒免疫反應(yīng)
　　ML323處理顯著降低小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中VSV介導(dǎo)的IFN-β、ISG15的表達(dá)，促進(jìn)VSV病毒復(fù)制;ML323處理可明顯降低VSV誘導(dǎo)的小鼠腹腔滲出液以及外周血中IFN-β的含量，同時(shí)小鼠肝、肺、脾組織內(nèi)IFN-β mRNA也明顯下降，相對(duì)的病毒復(fù)制量明顯提高。肺組織石蠟切片H&E染色結(jié)果也顯示ML323處理組炎性細(xì)胞滲出情況較對(duì)照組更為明顯

21、。
　　結(jié)論：
　　1.USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體特異性結(jié)合TBK1，去除TBK1 K48位偶聯(lián)的泛素化修飾，抑制TBK1降解，進(jìn)而促進(jìn)TLR及RIG-Ⅰ介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素表達(dá)。
　　2.USP1-UAF1去泛素化酶特異性抑制劑ML323在小鼠病毒感染模型中，抑制機(jī)體抗病毒固有免疫反應(yīng)，并促進(jìn)病毒復(fù)制。
　　創(chuàng)新性及研究意義：
　　1.發(fā)現(xiàn)了特異性去除TBK1 K48偶聯(lián)的泛素化修飾的去泛素化酶USP