豬鏈球菌豬溶血素誘導(dǎo)血小板聚集和血小板-中性粒細(xì)胞聚集體形成機(jī)制的研究.pdf

1、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis serotype2，S.suis2）作為新發(fā)的重要人獸共患病病原體，在我國江蘇和四川引起暴發(fā)流行，主要引起中毒性休克綜合征（streptococcal toxic shock syndrome，STSS）、腦膜炎、菌血癥等臨床表征，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。中毒性休克綜合征患者臨床癥狀主要為高熱、休克、皮膚黏膜出血、彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular

2、 coagulation，DIC）等，最終引起患者多器官微循環(huán)障礙、功能衰竭，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。中毒性休克綜合征死亡患者解剖發(fā)現(xiàn)，多臟器出現(xiàn)微血栓，血液凝固性降低，說明患者凝血系統(tǒng)出現(xiàn)了紊亂，提示豬鏈球菌與宿主血液系統(tǒng)的相應(yīng)成分發(fā)生相互作用，引起了患者凝血功能障礙，但是具體的毒力因子與作用機(jī)制仍未闡明。篩選出相應(yīng)的毒力因子，并且闡明相應(yīng)的作用機(jī)制，對于豬鏈球菌中毒性休克綜合征患者的臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。
　　血小板作

3、為人體血液中的主要成分，在生理性止血、凝血過程中發(fā)揮著核心作用，血小板的激活是血栓形成的啟動(dòng)因素同時(shí)血小板也是構(gòu)成微血栓的主要成分。通過病人出血的臨床表現(xiàn)和微血栓的解剖學(xué)特征，我們猜想可能是豬鏈球菌的某種毒力因子與血小板相互作用，激活了血小板，活化后的血小板粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面、相互聚集，形成了微血栓。由于血栓的形成，消耗掉了血液循環(huán)中大量的血小板，導(dǎo)致了凝血功能降低，所以病人會(huì)出血、休克。為了驗(yàn)證我們的猜想，我們以2005年的高致病

4、標(biāo)準(zhǔn)測序株05ZYH33為主要研究對象，尋找與血小板相互作用的毒力因子并探討相關(guān)的作用機(jī)制，我們設(shè)計(jì)并且進(jìn)行了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。
　　本實(shí)驗(yàn)室保存了05ZYH33菌株，同時(shí)構(gòu)建了豬溶血素（Suilysin，SLY）基因缺失株ΔSLY、溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein，MRP）基因缺失株ΔMRP、腺苷合成酶（Ssads）基因缺失株ΔSsads、H因子結(jié)合蛋白（factor H binding prot

5、ein）基因缺失株ΔFHb等突變株，為我后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了菌株材料。
　　本實(shí)驗(yàn)首先使用分離到的高致病性豬鏈球菌野生株05ZYH33細(xì)菌菌體與健康人全血中分離到的血小板相互作用，通過檢測血小板活化標(biāo)志物ATP、CD41a、CD62P等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌菌體并沒有引起血小板的激活，與陰性對照沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。之后我們又使用05ZYH33對數(shù)中期和穩(wěn)定期的培養(yǎng)上清與血小板相互作用，發(fā)現(xiàn)ATP、CD41a和CD62P等血小板活化指標(biāo)只有在穩(wěn)

6、定期上清與血小板相互作用時(shí)才會(huì)出現(xiàn)不同程度的增加，與陰性對照THB培養(yǎng)基組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而對數(shù)中期培養(yǎng)上清不能激活血小板。說明了豬鏈球菌上清中存在著某種成分可以激活血小板，并且該物質(zhì)是在細(xì)菌穩(wěn)定期才會(huì)分泌到菌外，而豬鏈球菌菌體自身成分并不能直接激活血小板。同時(shí)，我們使用血小板聚集儀發(fā)現(xiàn)，只有豬鏈球菌穩(wěn)定期分泌的這種物質(zhì)可以誘導(dǎo)血小板聚集，菌體本身也不能夠誘導(dǎo)血小板聚集，血小板聚集結(jié)果與血小板激活結(jié)果相一致，進(jìn)一步說明了豬鏈球菌在

7、穩(wěn)定期分泌的某種毒素可以激活血小板，并且進(jìn)一步誘導(dǎo)活化的血小板聚集。
　　為了進(jìn)一步探究豬鏈球菌激活血小板的毒力因子，我們使用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的多種基因缺失株穩(wěn)定期培養(yǎng)上清與血小板相互作用，來檢測血小板ATP、CD41a和CD62P表達(dá)情況和血小板聚集程度，發(fā)現(xiàn)只有突變株ΔSLY不能激活血小板和誘導(dǎo)血小板聚集。由于SLY作為一種外分泌的毒素，不存在與豬鏈球菌表面，并且只有在穩(wěn)定期才會(huì)分泌，突變株ΔSLY由于SLY基因缺失，上清中不

8、能表達(dá)SLY，這些結(jié)果初步證實(shí)了豬鏈球菌分泌的豬溶血素SLY是激活并引起血小板聚集的毒力因子。
　　我們通過基因工程方法構(gòu)建了重組豬溶血素（rSLY）工程菌，體外表達(dá)純化了SLY，使用SLY與血小板相互作用，可以激活血小板，并且通過血小板聚集儀和電子顯微鏡我們從宏觀和微觀上證實(shí)了SLY誘導(dǎo)血小板聚集，而Fhb、MRP、Ssads等已知的豬鏈球菌毒力因子都不能夠引起血小板聚集，結(jié)合豬鏈球菌菌體、對數(shù)期上清、穩(wěn)定期上清引起血小板聚集結(jié)

9、果，進(jìn)一步證實(shí)了SLY是豬鏈球菌唯一的可以誘導(dǎo)血小板聚集的毒力因子。
　　篩選到毒力因子之后我們進(jìn)一步探究了SLY激活血小板的具體的機(jī)制。因?yàn)镾LY可以在細(xì)胞膜上成孔，我們猜想SLY是否是通過在血小板表面成孔的方式激活了血小板，首先我們通過向05ZYH33穩(wěn)定期上清和SLY中加入一定濃度膽固醇，與SLY結(jié)合，封閉其成孔能力，發(fā)現(xiàn)不能激活血小板，同時(shí)我們用第353位氨基酸突變的喪失打孔能力的SLY（SLY（P353V））來刺激血小板

10、，也不能夠激活血小板，另外，我們使用磷脂酶C（PLC）抑制劑U73122并不能抑制SLY誘導(dǎo)的血小板活化，說明了SLY不是通過血小板表面的G蛋白偶聯(lián)受體而是通過在血小板表面成孔而激活了血小板。然后我們向富血小板血漿（PRP）中加入常規(guī)的鈣離子螯和劑EGTA，發(fā)現(xiàn)可以明顯的抑制05ZYH33穩(wěn)定期上清和SLY誘導(dǎo)的血小板活化和聚集，說明SLY誘導(dǎo)的血小板聚集需要血漿中的鈣離子參與。我們又通過鈣離子內(nèi)流實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SLY作用于血小板會(huì)引起血小

11、板鈣離子內(nèi)流，膽固醇封閉SLY成孔之后，再與血小板相互作用不會(huì)引起鈣離子內(nèi)流，同時(shí)血小板也不會(huì)激活，這些結(jié)果綜合起來說明了SLY通過在血小板表面打孔，導(dǎo)致了鈣離子內(nèi)流，激活了血小板。
　　血小板活化后表面分子GPⅡb/Ⅲa亞基CD41a含量僅僅增加了約30％，而GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原（Fg）結(jié)合能力大大增加，使用Eptifibatide封閉掉GPⅡb/Ⅲa與Fg結(jié)合位點(diǎn)之后，明顯的降低了SLY引起的血小板聚集，說明了SLY激活

12、血小板后導(dǎo)致了GPⅡb/Ⅲa構(gòu)想變化，與Fg親和力增強(qiáng)，從而引起了血小板聚集。阿司匹林作為環(huán)加氧酶（COX）的抑制劑，同樣可以降低SLY誘導(dǎo)的血小板聚集率，通過Eptifibatide和阿司匹林兩種抑制劑對血小板聚集效果的評價(jià)，我們發(fā)現(xiàn)GPⅡb/Ⅲa在血小板聚集中起著主要作用。Eptifibatide同時(shí)可以略微降低一點(diǎn)CD62P的表達(dá)量，說明了GPⅡb/Ⅲa與Fg結(jié)合能夠把胞外信號，傳遞到胞內(nèi)，一定程度上降低了血小板脫顆粒程度。

13、>　　SLY引起血小板鈣離子內(nèi)流之后，激活血小板內(nèi)相應(yīng)的鈣調(diào)蛋白，引起血小板活化。我們使用肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）抑制劑ML-7和Rho蛋白抑制劑Y27632與血小板相互作用，來封閉相應(yīng)的鈣調(diào)蛋白的活性，結(jié)果顯示ML-7抑制了血小板的激活，而Y27632對血小板活化沒有影響，同時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)只有ML-7抑制了血小板CD62P高表達(dá)，說明了鈣離子進(jìn)入血小板內(nèi)激活了肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），MLCK活化肌球蛋白輕鏈（MLC）

14、，導(dǎo)致血小板脫顆粒，釋放CD62P到血小板表面，而不是通過PLC-IP3/DAG-MLCK和Rho-ROCK-MLCK途徑激活了血小板。
　　CD62P作為一種整合素蛋白，可以與中性粒細(xì)胞（PMNs）表面的受體PSGL-1結(jié)合，形成血小板/中性粒細(xì)胞聚集體（platelets/neutrophils aggregation，PNA），使用anti-CD62P單克隆抗體可以明顯降低PNA形成率，證實(shí)了血小板通過其表面P-選擇素與PM

15、Ns形成PNA。PNA在中性粒細(xì)胞滲出內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)炎癥部位起著關(guān)鍵作用。
　　我們使用05ZYH33野生株和ΔSLY基因突變株分別感染BALB/c小鼠，36h后05ZYH33野生株感染的小鼠與ΔSLY基因突變株感染的小鼠相比，全血中血小板體積增大和數(shù)量降低，在05ZYH33野生株感染的小鼠肝臟組織病理切片中發(fā)現(xiàn)了微血栓和凝固性壞死，ΔSLY基因突變株感染的小鼠中未見明顯異常，說明了SLY體內(nèi)誘導(dǎo)了血小板活化，并且形成了微血栓。

16、r>　　總結(jié)來講，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌分泌的SLY，通過在血小板膜上成孔的方式引起鈣離子內(nèi)流，激活血小板內(nèi)的MLCK與膜表面GPⅡb/Ⅲa，依靠GPⅡb/Ⅲa的活化和CD62P的高表達(dá)介導(dǎo)了血小板的聚集和血小板/中性粒細(xì)胞聚集體（PNA）的形成，血小板的聚集會(huì)導(dǎo)致微血栓的形成，對多組織器官造成損傷，同時(shí)由于血小板消耗，會(huì)導(dǎo)致病人出血嚴(yán)重，另外血小板/中性粒聚集體的形成會(huì)觸發(fā)炎癥反應(yīng)和促進(jìn)中性粒遷移，聚集體也會(huì)參與血栓的形成，多種機(jī)制的共同