基于流式細(xì)胞術(shù)的小鼠血小板聚集檢測方法的評價及川芎嗪抗血小板聚集功能的研究.pdf

1、目的：
　　動脈粥樣硬化及其伴發(fā)的血栓性事件已經(jīng)成為我國人口致殘及死亡的首要原因。這類疾病的發(fā)病原因在于血栓的形成，而血栓形成的始動因素主要是由于血小板的激活與聚集，因此抗血小板治療是治療該類疾病的基石。近年來，與臨床缺血事件發(fā)生可能有關(guān)的抗血小板藥物的“抵抗”現(xiàn)象越來越引起人們的重視，活血化瘀類中藥在治療該類疾病中具有一定的優(yōu)勢。但中藥的安全性和有效性以及抗血小板的作用機(jī)制仍需要動物實驗來進(jìn)一步明確。傳統(tǒng)的血小板功能檢測方法無法

2、應(yīng)用于小鼠。因此本研究擬建立流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測小鼠血小板聚集功能的平臺，并利用該平臺檢測P2Y12受體拮抗劑、GPⅡb/Ⅲa受體阻斷劑及中藥提取物川芎嗪（TMPZ）對小鼠血小板聚集功能的影響。
　　方法：
　　實驗一，選取35例健康志愿者和66例冠心?。–HD）患者，分別采用FCM和光學(xué)比濁法（LTA）檢測其血小板聚集率，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析及Bland-Altman分析，評價FCM檢測血小板聚集率與LTA檢測結(jié)

3、果的一致性。
　　實驗二，CD61-PE和CD61-FITC標(biāo)記的C57BL/6J小鼠血小板（n=5）混合后加入二磷酸腺苷（ADP)誘導(dǎo)血小板聚集，通過分析同時標(biāo)記兩種熒光染料的細(xì)胞群占所有血小板的百分比來評估血小板的聚集功能；C57BL/6J小鼠（n=8）經(jīng)FCM檢測ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率，誘聚時間分別為0、3、6、10、15和20min；16只雄性 C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組[0.01 mL/(g·d)]和氯吡格

4、雷組[11.26 mg/(kg·d)]灌胃7d，F(xiàn)CM檢測小鼠血小板聚集率；16只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組和替羅非班組（5μg/mL），體外給予藥物干預(yù)，F(xiàn)CM檢測其血小板聚集率；32只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4組，取血后體外分別給予生理鹽水和TMPZ低、中、高濃度（終濃度分別為0.5、1、2 mg/mL）進(jìn)行干預(yù)，F(xiàn)CM檢測其血小板聚集率。
　　結(jié)果：
　　實驗一，健康人組LTA和FCM檢測血小板

5、聚集率結(jié)果分別為(57.74±15.39)％、(60.74±15.15)%，差異未見統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CHD組LTA和FCM檢測血小板聚集率結(jié)果分別為(63.46±20.75)%、(66.47±23.23)%，差異未見統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；健康人組、CHD組及所有研究對象LTA和FCM血小板聚集率結(jié)果經(jīng)Pearson相關(guān)分析，結(jié)果呈正相關(guān)性（r值分別為0.871、0.812、0.827，P均<0.01）；健康人組、CHD

6、組、所有研究對象經(jīng)Bland-Altman評價，提示該兩種檢測方法具有較好的一致性。
　　實驗二，經(jīng)ADP（20μmol/L）誘導(dǎo)激活后，含有雙色熒光標(biāo)記的細(xì)胞群即血小板聚集體明顯增多（P<0.001）；經(jīng)ADP（20μmol/L）誘導(dǎo)的小鼠血小板聚集率隨誘聚時間增加而升高，在約10min時趨于平緩；FCM檢測小鼠服用氯吡格雷后其血小板聚集率顯著降低（P<0.001）；FCM檢測替羅非班可顯著降低小鼠血小板聚集率（P<0.01）；