丁苯酞抗血小板聚集作用及其機制和NOD2在血小板中表達及功能的研究.pdf

1、目的
　　血管損傷時血小板活化參與損傷修復反應，對于生理止血過程十分重要。病理性條件下如動脈粥樣板塊自發(fā)性破裂或斑塊侵蝕等，循環(huán)血液中的血小板異?；罨纬蓜用}血栓將導致血管狹窄或閉塞，致使機體組織局部缺血或供血中斷。這些是冠心病、急性冠脈綜合征、缺血性腦卒中等當今威脅我國人民及許多發(fā)達國家人民健康的首要疾病的病理基礎。隨著對血小板功能研究的不斷深入，研究表明抑制血小板活化的抗血小板藥對冠心病、中風的預防、治療效果肯定。
　　

2、丁苯酞(3-n-butylphthalide，NBP)是從芹菜籽中提取出來的特定成份并進行結構修飾而得到的新型化合物。2002年，丁苯酞（商品名為恩必普）獲得中國SFDA批準，成為我國腦血管領域第一個擁有自主知識產權的一類新藥。臨床試驗證實，口服制劑及針劑丁苯酞具有很強的抗腦缺血作用，對急性缺血性腦卒中的治療有滿意的療效，同時副作用較小。2010年，丁苯酞軟膠囊被編入我國《國家處方集》腦血管病指導用藥，臨床用于治療輕、中度急性缺血性腦卒

3、中的各個病理過程。
　　以往的研究，使用體外、半體外比濁法證實丁苯酞對膠原、ADP、花生四烯酸誘導的大鼠血小板聚集有明顯抑制作用;對大鼠灌胃給予丁苯酞后，觀察到左旋體和消旋體丁苯酞可劑量依賴性地抑制大鼠血栓形成，并能使剪鼠尾后的出血時間延長2.1倍。然而，丁苯酞抗血栓、抗血小板作用的具體機制仍不明確。本研究對丁苯酞（消旋體及左旋體）體外抗人血小板聚集活性及其抗血小板的作用靶點進行了研究，從而對臨床應用該藥物給出一定的參考價值。

4、r>　　方法
　　實驗時，我們當場采集健康志愿獻血者的肘靜脈全血。使用FITC-PAC-1標記血小板活化糖蛋白GPⅡb/Ⅲa，通過全血法流式細胞儀檢測丁苯酞對人血小板活化的作用;我們制備了未經阿斯匹林處理和經阿司匹林處理人的洗滌系血小板，用丁苯酞（消旋體及左旋體）處理血小板后，加入血小板激動劑ADP、凝血酶、膠原、U46619、花生四烯酸誘導血小板聚集，觀察并記錄其抗血小板聚集活性及對血小板ATP釋放的影響;對其作用機制進行探討時

5、，我們使用柱層析法，加入[3H]腺嘌呤標記，檢測丁苯酞對forsklin升高的ADP誘導的血小板內cAMP水平的影響;通過使用高效液相法檢測酶反應體系中剩余底物的含量，進而反映丁苯酞對血小板提取的磷酸二酯酶(PDEs)活性的作用;此外，我們使用ELISA試劑盒，檢測丁苯酞對ADP、凝血酶、膠原誘導的血小板內血栓烷A2生成的作用;最后，我們使用Fluo-3負載血小板，檢測丁苯酞對ADP誘導的血小板內游Ca2+水平的影響。
　　結果<

6、br>　　根據(jù)我們的實驗結果，在全血條件下，丁苯酞（消旋體及左旋體）300μM可顯著抑制由ADP10μM誘導的血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的活化;在10-300μM范圍中，丁苯酞（消旋體及左旋體）可顯著濃度依賴性地抑制由ADP10μM、凝血酶0.05 U/mL、膠原1μg/mL、U466191μM、花生四烯酸0.5 mM誘導的人洗滌血小板聚集和ATP釋放;同時，我們觀察到丁苯酞對ADP、凝血酶誘導的聚集的抑制作用，在未經阿司匹林處理條件下

7、強于經阿司匹林處理條件，而丁苯酞對U46619誘導的聚集的抑制作用在經阿司匹林處理后反而相對更強，提示其抗血小板作用可能與抑制TXA2的生成有關;丁苯酞（消旋體及左旋體）300μM在從人血小板提取的磷酸二酯酶反應體系中，可顯著增高酶底物cAMP的剩余含量，證明丁苯酞有抑制磷酸二酯酶的作用;此外，丁苯酞（消旋體及左旋體）300μM對ADP10μM誘導的血小板內cAMP降低的抑制作用無統(tǒng)計學差異，提示其作用靶點非P2Y12-Gi信號通路;最

8、后，在10-300μM的濃度范圍內，丁苯酞濃度依賴性地顯著抑制ADP、凝血酶和膠原誘導的TXA2生成;丁苯酞（消旋體及左旋體）100μM能夠明顯降低由ADP10μM誘導的血小板內Ca2+升高。
　　結論
　　1.丁苯酞（消旋體及左旋體）在體外對多種激動劑誘導的血小板激活具有較強的抑制作用。
　　2.丁苯酞（消旋體及左旋體）抗血小板作用的機制主要為抑制TXA2的生成和抑制磷酸二酯酶。
　　第二部分NOD2在血小板中

9、的表達與功能的研究
　　血小板是從骨髓來源巨核細胞上脫落下來的無核“細胞碎片”，流動于機體血液循環(huán)系統(tǒng)內。血小板的主要功能是參與凝血和止血，限制血管損傷處進一步出血。然而，血小板的異常激活將會導致急性冠脈綜合征、缺血性腦中風等嚴重動脈血栓性疾病。此外，血小板與動脈粥樣硬化、腫瘤生長和轉移等病理過程有關聯(lián)?；罨难“迥軌虮磉_分泌炎性因子如P-選擇素及CD40L等。許多在白細胞表達的信號分子在血小板中也有表達。NOD作為白細胞表達的

10、模式識別受體，在宿主抗侵入細菌的天然免疫(innate immunity)中具有重要作用。NOD主要有NOD1和NOD2。越來越多的證據(jù)表明，NOD2基因突變與炎癥性腸疾病Blau綜合征的發(fā)病有密切關聯(lián)，也與克隆氏病的易感性增加相關。目前已知NOD2主要在單個核細胞中表達，但NOD2是否在血小板中表達，以及是否在血小板有功能均未見報道。
　　我們首次發(fā)現(xiàn)血小板NOD2表達而且有功能。我們分別在mRNA水平及蛋白水平發(fā)現(xiàn)人及小鼠血小

11、板表達高水平的NOD2，并發(fā)現(xiàn)野生型小鼠腹腔注射NOD2受體激動劑MDP，能夠增強血小板激動劑ADP、thrombin、collagen誘導的小鼠血小板聚集及ATP釋放，而NOD2受體敲除小鼠腹腔注射NOD2的激動劑MDP，不能增強激動劑ADP、thrombin、collagen誘導的血小板聚集及ATP釋放。接著，我們檢測了腹腔注射MDP對野性型及NOD2受體敲除小鼠血小板凝塊收縮和血小板鋪展的影響。結果顯示，MDP能夠顯著加快野生型小

12、鼠血小板凝塊收縮速度，但是對血小板鋪展沒有明顯作用;NOD2受體敲除小鼠MDP組與NS組血小板凝塊收縮速度均相對減慢，兩組間無明顯差異;NOD2受體敲除小鼠MDP組與NS組血小板鋪展亦無明顯差異，并與野生型小鼠的血小板鋪展面積相似。最后，我們還應用電鏡分析血小板的形態(tài)結構，發(fā)現(xiàn)給予MDP刺激后野生型小鼠血小板明顯具有活化趨勢，而對NOD2受體敲除小鼠血小板的結構沒有明顯的影響。我們的結論是血小板表達NOD2，NOD2激活促進血小板活化。