miR-146a對血小板免疫炎癥的影響及其機制的研究.pdf

1、目的:
　　探討miR-146a對巨核細胞裂解產(chǎn)生的血小板免疫炎癥功能的影響及miR-146a對血小板免疫炎癥功能調(diào)控作用的機制。
　　方法：
　?。?）通過體外培養(yǎng)雙分化潛能的K562細胞，采用佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）誘導其向巨核細胞系分化，并最終可產(chǎn)生血小板；
　?。?）通過向分化的巨核細胞內(nèi)分別導入miR-146a模擬物和阻遏物，轉(zhuǎn)染設置5個組，正常對

2、照組：佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組；miR-146amimic組：miR-146a模擬物導入佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組；miR-146ainhibitor組：miR-146a抑制物導入佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組；mimic-NC組：將miR-146a模擬物陰性對照導入佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組;inhibitor-NC組：將miR-146a抑制物陰性對照導入佛波酯誘導K562細胞產(chǎn)生血小板組。
　　（

3、3）用q-RT-PCR檢測各組細胞中miR-146a表達水平的變化；用ELISA檢測血小板免疫炎癥分子IL-6、TNF-α分子水平；用RT-PCR檢測各組細胞中血小板免疫炎癥分子——NF-ΚBmRNA表達水平；用WesternBlotting檢測各組細胞中血小板免疫炎癥分子——TLR4、NF-ΚB蛋白表達水平。
　?。?）利用三種常用的靶基因預測軟件（TargetScan;PicTar;miRanda）預測miR-146a可能作用

4、的靶基因，結(jié)合miR-146a在調(diào)控血小板免疫炎癥過程中的作用，在預測結(jié)果交集中篩選出IRAK1基因為潛在的靶基因；
　?。?）通過熒光素酶報告基因法驗證IRAK1是否含有miR-146a的靶位點；
　?。?）通過檢測過表達或抑制表達miR-146a后細胞中靶基因IRAK1mRNA水平及蛋白水平的變化，從而確定miR-146a對靶基因IRAK1的影響。
　　結(jié)果：
　　（1）佛波酯成功誘導k562細胞分化為產(chǎn)血小

5、板巨核細胞；
　?。?）與miR-146amimic陰性對照組相比，miR—146amimic組miR—146a的表達顯著升高（約77.5倍），細胞上清液中IL-6、TNF-a顯著降低（p<0.05）；TLR4蛋白表達顯著升高（P<0.05），NF-KBmRNA及NF-KB蛋白明顯降低(P<0.05)；與miR-146ainhibitor陰性對照組相比，miR-146ainhibitor組miR-146a表達下降（約7.5倍），細

6、胞上清液中IL-6、TNF-a顯著升高（p<0.05）；TLR4蛋白表達顯著降低（P<0.05），NF-KBmRNA及NF-KB蛋白明顯升高(P<0.05)；
　　（3）生物信息軟件預測出IRAK1為hsa-mir-146a作用的靶基因；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，Pmir-Report-WT-IRAK1和miR-146amimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶報告基因活性明顯受到抑制，而Pmir-Report-MUT-IRAK1和miR

7、-146amimic共轉(zhuǎn)染組、Pmir-Report-WT-IRAK1和mimic-NC共轉(zhuǎn)染組、Pmir-Report-MUT-IRAK1和mimic-NC共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶報告基因活性均無明顯變化；miR-146a過表達可抑制IRAK1蛋白表達水平，而對IRAK1mRNA水平無影響。
　　結(jié)論：
　　（1）miR-146a調(diào)控血小板免疫炎癥分子IL-6、TNF-α的表達；
　　（2）證實miR-146a可能是通過其