miR-146a在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(AcuteRespiratory Distress Syndrome，ARDS)指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的肺部炎性反應(yīng)，使肺泡-毛細(xì)血管上皮細(xì)胞及肺部屏障結(jié)構(gòu)受損，肺氣體交換功能發(fā)生障礙，是一種以急性、進(jìn)行性、頑固性低氧血癥為特征的臨床綜合征，是目前導(dǎo)致危重病人死亡的主要原因。盡管不斷出現(xiàn)新的治療ALI/ARDS的方法

2、，包括肺保護(hù)性通氣策略、體外膜肺氧合、高容量血液濾過(guò)等，但其死亡率依然高達(dá)30％～50％。在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肺泡巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)肺組織受到肺內(nèi)外各種因素刺激時(shí)，可以活化肺泡巨噬細(xì)胞膜上的Toll受體(Toll-like receptors，TLRs)，再經(jīng)信號(hào)蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)活化核轉(zhuǎn)錄因子-KappaB（nuclear factor-KappaB，NF-κB），誘導(dǎo)大量炎癥因子的表達(dá)釋放，促使炎癥反

3、應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大，形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng)，導(dǎo)致ALI/ARDS的發(fā)生。因此，抑制肺泡巨噬細(xì)胞過(guò)度活化、降低肺內(nèi)炎癥反應(yīng)是治療ALI/ARDS的根本措施。microRNA-146a(miR-146a)在固有免疫反應(yīng)的調(diào)控中具有重要作用，它通過(guò)靶向沉默TLRs/NF-κB信號(hào)通路中的兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，能夠阻斷NF-κB活化，從而抑制炎癥因子的釋放，有望成為抑制肺泡巨噬細(xì)胞過(guò)度活化，降低肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的有效措施。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)體外構(gòu)建肺泡巨噬

4、細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，觀察miR-146a和炎癥因子的表達(dá)變化，分析miR-146a在肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用，然后經(jīng)體外轉(zhuǎn)染miR-146amimic上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)，觀察miR-146a對(duì)炎癥因子和炎癥信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，分析它在肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制，最后于體內(nèi)構(gòu)建大鼠ALI模型，觀察miR-146a在肺損傷組織中的表達(dá)變化，并結(jié)合體外研究結(jié)果，探討其在大鼠ALI模型中的調(diào)控作用及作用

5、機(jī)制，為臨床治療ALI提供新的治療思路。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　1體外實(shí)驗(yàn)
　　(1)將體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)按2×106個(gè)/孔接種于六孔板，細(xì)胞貼壁90min，加入終濃度1μg/ml LPS處理細(xì)胞，于刺激0h、3h、6h、12h的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)分別檢測(cè)細(xì)胞中TNF-α mRNA和miR-146a的表達(dá)變化，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA

6、)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白的表達(dá)變化;
　　(2)將體外培養(yǎng)的NR8383細(xì)胞按1.5×106個(gè)/孔接種于六孔板，細(xì)胞貼壁90min，加入50nM濃度的miR-146a mimic轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞24h后收集細(xì)胞。用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-146a上調(diào)的表達(dá)倍數(shù)和miR-146a兩個(gè)靶基因IRAK-1 mRNA和TRAF-6 mRNA的表達(dá)變化，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IRAK-1和TRAF-6的

7、表達(dá)變化，驗(yàn)證miR-146a轉(zhuǎn)染的有效性以及驗(yàn)證miR-146a的靶基因;
　　(3)將體外培養(yǎng)的NR8383細(xì)胞按1.5×106個(gè)/孔接種于六孔板，細(xì)胞貼壁90min，加入50nM濃度的miR-146amimic轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞24h，再加入終濃度1μg/ml LPS處理細(xì)胞6h后收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液。用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中TNF-α mRNA和miR-146a的表達(dá)變化，用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白

8、的表達(dá)變化，用免疫熒光及Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65的核移位變化，明確miR-146a對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及作用機(jī)制。
　　2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　選擇雄性SPF級(jí)8～10周齡SD大鼠，按7.5mg/kg的脂多糖，經(jīng)氣道滴入大鼠肺部誘導(dǎo)ALI模型，造模6小時(shí)后處死大鼠，檢測(cè)肺損傷程度。留取右肺行肺泡灌洗，用ELISA檢測(cè)灌洗液中TNF-α蛋白的表達(dá)變化;留取左肺用RT-qPCR檢測(cè)肺組織中miR-146a以及

9、TNF-α mRNA的表達(dá)變化、用Western blot檢測(cè)NF-κB p65含量變化。
　　結(jié)果:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1) LPS刺激NR8383細(xì)胞后，誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α的表達(dá)變化，其中3、6、12h時(shí)間點(diǎn)的TNF-αmRNA表達(dá)量分別是0h對(duì)照組的67.48±24.52倍（P＜0.01）、29.53±4.26倍(P＜0.01)、11.37±2.52倍(P＜0.01);細(xì)胞上清液中TNF-α

10、蛋白的含量于LPS刺激0h后逐漸上升，0h為29.53±7.80pg/ml、3h為359.80±57.54pg/ml(P＜0.01)、6h為586.22±30.57 pg/ml(P＜0.01)、12h為729.22±50.40 pg/ml(P＜0.01)。
　　(2) LPS刺激NR8383細(xì)胞后，誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α的表達(dá)變化，同時(shí)也誘導(dǎo)了miR-146a的表達(dá)變化，3h與0h miR-146a表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、

11、6h和12hmiR-146a的表達(dá)量逐漸升高，分別是0h的5.33±0.81倍（P＜0.01）和8.21±1.19倍(P＜0.01)。
　　(3)轉(zhuǎn)染50nM濃度的miR-146a mimic入NR8383細(xì)胞24h后，與control相比較，miR-146a的表達(dá)量上調(diào)至24.55±6.14倍(P＜0.01)，miR-146a的靶基因IRAK-1 mRNA和TRAF-6 mRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化，而IRAK-1和TRAF-6蛋白

12、表達(dá)水平分別下降至0.73±0.05倍（P＜0.05）和0.64±0.09倍（P＜0.05）。
　　(4)轉(zhuǎn)染50nM濃度的miR-146amimic入NR8383細(xì)胞24h后，給予LPS刺激6h后，相對(duì)control組，轉(zhuǎn)染miR-146a mimic組TNF-α mRNA表達(dá)下降至0.47±0.06倍（P＜0.05），細(xì)胞上清液中TNF-α蛋白從616.6±42.28pg/ml下降至211.5±30.39pg/ml（P＜0.0

13、1），細(xì)胞漿中NF-κB p65蛋白含量增加至1.74±0.11倍（P＜0.05），細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白含量下降至0.56±0.12倍(P＜0.05)，NF-κBp65核移位明顯受到抑制。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　LPS氣管滴入大鼠肺部6h后，ALI模型構(gòu)建成功:氧和指數(shù)＜300mmHg,肺病理?yè)p傷嚴(yán)重、模型組肺泡灌洗液中TNF-α蛋白為506.4±40.3pg/ml，明顯高于對(duì)照組48.51±12.11pg/

14、ml(P＜0.01);相對(duì)于對(duì)照組，模型組肺組織細(xì)胞漿中NF-κB p65蛋白含量下降至0.37±0.14倍(P＜0.05)，細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白含量增加至2.43±0.12倍（P＜0.05）、TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)了3.61±1.03倍(P＜0.05)，miR-146a的表達(dá)上升2.07±0.26倍（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，miR-146a通過(guò)靶向作用于TLR