免疫性血小板減少癥患者血小板計數(shù)對ADAMTS13和VWF活性的影響.pdf

1、目的:免疫性血小板減少癥(ITP)是一種常見的血液系統(tǒng)自身免疫性疾病。其年發(fā)病率在歐美國家約為5/10萬-10/10萬[1]。ITP以外周血血小板計數(shù)減少和骨髓巨核細胞成熟受阻為主要特點，臨床表現(xiàn)主要為皮膚粘膜出血，嚴重病例可發(fā)生內(nèi)臟出血。從理論上來講，ITP患者的血小板計數(shù)與其臨床出血程度應成負相關，即血小板計數(shù)越低，患者出血風險越高。但在實際臨床過程中卻發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)ITP患者即使血小板計數(shù)重度減低，甚至低于10×109/L時也并未發(fā)

2、生明顯的出血表現(xiàn)。這提示在人體內(nèi)可能存在某種或某些代償機制，在血小板計數(shù)減低的情況下通過對止凝血系統(tǒng)中某些相關因子的調(diào)節(jié)作用來減低患者的出血風險。
　　血管性血友病因子(VWF)是血漿中一種重要的止血相關蛋白，它主要是由血管內(nèi)皮細胞和骨髓巨核細胞合成和分泌。VWF前體蛋白形成后，運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，兩兩在C端以二硫鍵結(jié)合形成二聚體，然后再轉(zhuǎn)運至高爾基體，在高爾基體內(nèi)實現(xiàn)多聚體化，形成大分子的VWF多聚體。成熟的VWF在初期止血和二期止血方

3、面均發(fā)揮著重要作用。在初期止血中，在血管損傷導致內(nèi)皮下膠原暴露時，VWF可介導血小板與膠原的結(jié)合，促進血小板粘附和聚集，從而于出血局部形成血小板血栓而達到止血的目的。另一方面，VWF通過非共價鍵與Ⅷ因子(FⅧ)結(jié)合形成復合物，作為FⅧ的載體來保護FⅧ不被水解，從而延長其半衰期。研究證實，正常人體血漿中VWF的分子量介于500-20，000kDa，而其分子量的大小是由一種稱為ADAMTS13的金屬蛋白酶來調(diào)節(jié)的。它是通過特異性地剪切VWF

4、-A2功能域內(nèi)的Tyr1605-Met1606之間的肽鍵來實現(xiàn)的，從而保證VWF多聚體以正常的分子量形式存在，這樣既可防止因分子量過大而發(fā)生血栓形成傾向，也不至于因分子量過小而造成出血風險。本研究的目的在于通過相關實驗來證實當血小板計數(shù)重度減低時，是否可以在體內(nèi)通過降低ADAMTS13對于VWF的水解活性來增加血漿中的VWF的分子量，進而增強VWF的止血活性，以減輕因血小板減低造成的出血風險。
　　方法:
　　1、研究對象分

5、為實驗組和正常對照組。(1)實驗組:收集2011年1月-2013年6月期間就診于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院的部分原發(fā)性ITP患者，所有患者均符合ITP的診斷標準（符合張之南主編的《血液病診斷及療效判定標準》第三版），且均不合并存在高血壓、糖尿病、急慢性感染性疾病和免疫風濕性疾病等。進一步分為治療前組和治療后組:①治療前組:為治療前血小板計數(shù)≤10×109/L且白細胞計數(shù)和血紅蛋白均在正常值范圍內(nèi)的ITP患者，共50例;②治療后組:治療前組的I

6、TP患者中經(jīng)治療后血小板計數(shù)恢復正常(PLT≥100×109/L)的患者，共30例。(2)正常對照組:為例行查體的血常規(guī)和凝血常規(guī)正常的健康人，無高血壓、冠心病、糖尿病、免疫風濕性疾病和腦血管疾病等，且未服用任何藥物，共50例，男女各25例，年齡20-69歲，中位年齡48歲。
　　2、標本采集:取患者和正常對照人群的外周靜脈血，以枸櫞酸鈉抗凝，離心后取血漿，-70℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　3、檢測項目:包括VWF抗原(VWF∶Ag)

7、、VWF活性（VWF膠原結(jié)合活性，即VWF∶CB）、VWF∶CB/VWF∶Ag比值和ADAMTS13體外活性。VWF∶Ag和VWF∶CB均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法進行測定。而ADAMTS13體外活性測定采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移VWF86底物法(FRET-VWF86)。
　　4、統(tǒng)計學分析:計量資料以Mann-WhitneyU檢驗是否正態(tài);符合正態(tài)分布后以均數(shù)±標準差（(x)±s）來表示。多組間比較采用單因素方差(One-W

8、ayANOVA)分析，方差齊選用SNK-q法，方差不齊選用采用Dunnett'sC檢驗。P值＜0.05視為具有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果:
　　1、VWF∶Ag測定:結(jié)果顯示，治療前組、治療后組和正常對照組測得的血漿VWF∶Ag分別為（0.97±0.46）、（0.99±0.55）和（0.96±0.41），P值＞0.05，表明ITP患者經(jīng)治療血小板恢復正常前后的VWF∶Ag無明顯變化，且與正常人群相比均無明顯差異。
　　2、

9、VWF∶CB測定:治療前組、治療后組和正常對照組的VWF∶CB分別為（2.08±0.46）、（1.09±0.35）和（1.13±0.41）。結(jié)果顯示:治療前組的VWF∶CB明顯高于正常對照組（P值＜0.05），也明顯高于治療后組（P值＜0.05），但治療后組的VWF∶CB與正常對照組沒有差異（P值＞0.05），這表明血小板減低(PLT≤10×109/L)患者較血小板正常者的血漿VWF∶CB明顯增高，但當其經(jīng)治療血小板恢復正常后（即治療后

10、組）其血漿VWF∶CB又降至正常人群水平。
　　3、VWF∶CB/VWF∶Ag比值:治療前組、治療后組和正常對照組的VWF∶CB/VWF∶Ag比值分別為(2.03±0.67)、(0.98±0.58)和（1.10±0.41）。結(jié)果顯示:治療前組的VWF∶CB/VWF∶Ag比值明顯高于正常對照組(P值＜0.05)，也明顯高于治療后組（P值＜0.05），但治療后組的VWF∶CB/
　　VWF∶Ag比值與正常對照組沒有差異（P值＞0

11、.05）。這表明血小板減低(PLT≤10×109/L)患者較血小板正常者的VWF∶CB/VWF∶Ag比值明顯增高，但當其經(jīng)治療血小板恢復正常后（即治療后組）其VWF∶CB/VWF∶Ag比值又降至正常人群水平。
　　4、ADAMTS13體外活性測定:采用FRET-VWF86測定結(jié)果顯示，治療前組、治療后組與正常對照組的ADAMTS13體外活性分別為(612.6±85.58)、(632±84.28)和(651.9±82.59)，P值=

12、0.312，P值＞0.05，三組間比較均無統(tǒng)計學差異，表明血小板重度減低的ITP患者經(jīng)治療血小板恢復正常前后的ADAMTS13本身的活性無明顯變化，且與正常人群相比不存在差異。
　　結(jié)論:
　　1、ITP患者在血小板重度減低時，其VWF∶Ag含量無明顯變化，ADAMTS13體外活性并無變化，但VWF活性(VWF∶CB)和VWF∶CB/VWF∶Ag比值均明顯增高，這表明在ITP患者體內(nèi)血小板計數(shù)的嚴重降低下調(diào)了ADAMTS13

13、對VWF的裂解活性，而ADAMTS13本身的活性并無改變。
　　2、對于ITP患者來說，當血小板計數(shù)重度減低時，可以通過降低ADAMTS13對于VWF的裂解活性來增加VWF多聚體的分子量，進而上調(diào)VWF的止血活性，從而作為機體的一種代償機制來降低ITP患者的出血風險。
　　3、通過ITP患者這一人體模型，首次證實血小板計數(shù)變化在體內(nèi)可以調(diào)節(jié)ADAMTS13對VWF的裂解活性，進而豐富和完善了血小板在體外可以促進ADAMTS1