免疫性血小板減少癥患者血小板計(jì)數(shù)對(duì)ADAMTS13和VWF活性的影響.pdf

1、目的:免疫性血小板減少癥(ITP)是一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)自身免疫性疾病。其年發(fā)病率在歐美國(guó)家約為5/10萬(wàn)-10/10萬(wàn)[1]。ITP以外周血血小板計(jì)數(shù)減少和骨髓巨核細(xì)胞成熟受阻為主要特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)主要為皮膚粘膜出血，嚴(yán)重病例可發(fā)生內(nèi)臟出血。從理論上來(lái)講，ITP患者的血小板計(jì)數(shù)與其臨床出血程度應(yīng)成負(fù)相關(guān)，即血小板計(jì)數(shù)越低，患者出血風(fēng)險(xiǎn)越高。但在實(shí)際臨床過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)ITP患者即使血小板計(jì)數(shù)重度減低，甚至低于10×109/L時(shí)也并未發(fā)

2、生明顯的出血表現(xiàn)。這提示在人體內(nèi)可能存在某種或某些代償機(jī)制，在血小板計(jì)數(shù)減低的情況下通過(guò)對(duì)止凝血系統(tǒng)中某些相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用來(lái)減低患者的出血風(fēng)險(xiǎn)。
　　血管性血友病因子(VWF)是血漿中一種重要的止血相關(guān)蛋白，它主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓巨核細(xì)胞合成和分泌。VWF前體蛋白形成后，運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，兩兩在C端以二硫鍵結(jié)合形成二聚體，然后再轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，在高爾基體內(nèi)實(shí)現(xiàn)多聚體化，形成大分子的VWF多聚體。成熟的VWF在初期止血和二期止血方

3、面均發(fā)揮著重要作用。在初期止血中，在血管損傷導(dǎo)致內(nèi)皮下膠原暴露時(shí)，VWF可介導(dǎo)血小板與膠原的結(jié)合，促進(jìn)血小板粘附和聚集，從而于出血局部形成血小板血栓而達(dá)到止血的目的。另一方面，VWF通過(guò)非共價(jià)鍵與Ⅷ因子(FⅧ)結(jié)合形成復(fù)合物，作為FⅧ的載體來(lái)保護(hù)FⅧ不被水解，從而延長(zhǎng)其半衰期。研究證實(shí)，正常人體血漿中VWF的分子量介于500-20，000kDa，而其分子量的大小是由一種稱(chēng)為ADAMTS13的金屬蛋白酶來(lái)調(diào)節(jié)的。它是通過(guò)特異性地剪切VWF

4、-A2功能域內(nèi)的Tyr1605-Met1606之間的肽鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)的，從而保證VWF多聚體以正常的分子量形式存在，這樣既可防止因分子量過(guò)大而發(fā)生血栓形成傾向，也不至于因分子量過(guò)小而造成出血風(fēng)險(xiǎn)。本研究的目的在于通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)當(dāng)血小板計(jì)數(shù)重度減低時(shí)，是否可以在體內(nèi)通過(guò)降低ADAMTS13對(duì)于VWF的水解活性來(lái)增加血漿中的VWF的分子量，進(jìn)而增強(qiáng)VWF的止血活性，以減輕因血小板減低造成的出血風(fēng)險(xiǎn)。
　　方法:
　　1、研究對(duì)象分

5、為實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組。(1)實(shí)驗(yàn)組:收集2011年1月-2013年6月期間就診于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院的部分原發(fā)性ITP患者，所有患者均符合ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)（符合張之南主編的《血液病診斷及療效判定標(biāo)準(zhǔn)》第三版），且均不合并存在高血壓、糖尿病、急慢性感染性疾病和免疫風(fēng)濕性疾病等。進(jìn)一步分為治療前組和治療后組:①治療前組:為治療前血小板計(jì)數(shù)≤10×109/L且白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白均在正常值范圍內(nèi)的ITP患者，共50例;②治療后組:治療前組的I

6、TP患者中經(jīng)治療后血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)正常(PLT≥100×109/L)的患者，共30例。(2)正常對(duì)照組:為例行查體的血常規(guī)和凝血常規(guī)正常的健康人，無(wú)高血壓、冠心病、糖尿病、免疫風(fēng)濕性疾病和腦血管疾病等，且未服用任何藥物，共50例，男女各25例，年齡20-69歲，中位年齡48歲。
　　2、標(biāo)本采集:取患者和正常對(duì)照人群的外周靜脈血，以枸櫞酸鈉抗凝，離心后取血漿，-70℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　3、檢測(cè)項(xiàng)目:包括VWF抗原(VWF∶Ag)

7、、VWF活性（VWF膠原結(jié)合活性，即VWF∶CB）、VWF∶CB/VWF∶Ag比值和ADAMTS13體外活性。VWF∶Ag和VWF∶CB均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法進(jìn)行測(cè)定。而ADAMTS13體外活性測(cè)定采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移VWF86底物法(FRET-VWF86)。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:計(jì)量資料以Mann-WhitneyU檢驗(yàn)是否正態(tài);符合正態(tài)分布后以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）來(lái)表示。多組間比較采用單因素方差(One-W

8、ayANOVA)分析，方差齊選用SNK-q法，方差不齊選用采用Dunnett'sC檢驗(yàn)。P值＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1、VWF∶Ag測(cè)定:結(jié)果顯示，治療前組、治療后組和正常對(duì)照組測(cè)得的血漿VWF∶Ag分別為（0.97±0.46）、（0.99±0.55）和（0.96±0.41），P值＞0.05，表明ITP患者經(jīng)治療血小板恢復(fù)正常前后的VWF∶Ag無(wú)明顯變化，且與正常人群相比均無(wú)明顯差異。
　　2、

9、VWF∶CB測(cè)定:治療前組、治療后組和正常對(duì)照組的VWF∶CB分別為（2.08±0.46）、（1.09±0.35）和（1.13±0.41）。結(jié)果顯示:治療前組的VWF∶CB明顯高于正常對(duì)照組（P值＜0.05），也明顯高于治療后組（P值＜0.05），但治療后組的VWF∶CB與正常對(duì)照組沒(méi)有差異（P值＞0.05），這表明血小板減低(PLT≤10×109/L)患者較血小板正常者的血漿VWF∶CB明顯增高，但當(dāng)其經(jīng)治療血小板恢復(fù)正常后（即治療后

10、組）其血漿VWF∶CB又降至正常人群水平。
　　3、VWF∶CB/VWF∶Ag比值:治療前組、治療后組和正常對(duì)照組的VWF∶CB/VWF∶Ag比值分別為(2.03±0.67)、(0.98±0.58)和（1.10±0.41）。結(jié)果顯示:治療前組的VWF∶CB/VWF∶Ag比值明顯高于正常對(duì)照組(P值＜0.05)，也明顯高于治療后組（P值＜0.05），但治療后組的VWF∶CB/
　　VWF∶Ag比值與正常對(duì)照組沒(méi)有差異（P值＞0

11、.05）。這表明血小板減低(PLT≤10×109/L)患者較血小板正常者的VWF∶CB/VWF∶Ag比值明顯增高，但當(dāng)其經(jīng)治療血小板恢復(fù)正常后（即治療后組）其VWF∶CB/VWF∶Ag比值又降至正常人群水平。
　　4、ADAMTS13體外活性測(cè)定:采用FRET-VWF86測(cè)定結(jié)果顯示，治療前組、治療后組與正常對(duì)照組的ADAMTS13體外活性分別為(612.6±85.58)、(632±84.28)和(651.9±82.59)，P值=

12、0.312，P值＞0.05，三組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明血小板重度減低的ITP患者經(jīng)治療血小板恢復(fù)正常前后的ADAMTS13本身的活性無(wú)明顯變化，且與正常人群相比不存在差異。
　　結(jié)論:
　　1、ITP患者在血小板重度減低時(shí)，其VWF∶Ag含量無(wú)明顯變化，ADAMTS13體外活性并無(wú)變化，但VWF活性(VWF∶CB)和VWF∶CB/VWF∶Ag比值均明顯增高，這表明在ITP患者體內(nèi)血小板計(jì)數(shù)的嚴(yán)重降低下調(diào)了ADAMTS13

13、對(duì)VWF的裂解活性，而ADAMTS13本身的活性并無(wú)改變。
　　2、對(duì)于ITP患者來(lái)說(shuō)，當(dāng)血小板計(jì)數(shù)重度減低時(shí)，可以通過(guò)降低ADAMTS13對(duì)于VWF的裂解活性來(lái)增加VWF多聚體的分子量，進(jìn)而上調(diào)VWF的止血活性，從而作為機(jī)體的一種代償機(jī)制來(lái)降低ITP患者的出血風(fēng)險(xiǎn)。
　　3、通過(guò)ITP患者這一人體模型，首次證實(shí)血小板計(jì)數(shù)變化在體內(nèi)可以調(diào)節(jié)ADAMTS13對(duì)VWF的裂解活性，進(jìn)而豐富和完善了血小板在體外可以促進(jìn)ADAMTS1