重組腺病毒介導Sox9表達對人椎間盤細胞退變的影響.pdf

1、研究背景：
　　腰背部疼痛是當今困擾人類的最常見骨科疾病之一，其原因有椎間盤退行性變、腰背部肌肉勞損等，其中有約4/5的病人是以下腰痛為主要病癥來醫(yī)院就診，下腰痛的最主要原因是椎間盤的退行性變。學者發(fā)現，椎間盤的退行性變與組織形態(tài)學、生物力學、遺傳學、基因分子學等有關。椎間盤是脊柱的重要組成部分，其在維持脊柱生理曲度及穩(wěn)定性方面起著重要的作用。其主要有周圍的纖維化組織，中間的髓核組織，以及上下的軟骨終板組成，為脊柱應力緩沖的主要結

2、構，起著彈性墊作用。椎間盤退變，在外力的作用下，其纖維環(huán)組織退變并破裂，中間的髓核組織通過破裂纖維環(huán)的缺口處脫出或者突出后方的椎管內，壓迫相應的脊髓和神經，脊髓和神經長期受壓，發(fā)生水腫、炎癥，進而引起腰背痛、下肢無力、疼麻等為主、甚至截癱的臨床癥狀。陳立等人對椎間盤退行性變的研究表明，在正常的生物應力作用下，軟骨終板上的蛋白聚糖合成和降解二者處于動態(tài)平衡，而在異常應力的作用下，軟骨終板的蛋白聚糖出現合成減少、但是降解增加，打破了這種動態(tài)

3、平衡，從而改變了椎間盤的原有組織結構成分，最終導致了椎間盤的退行性變。成年后的椎間盤細胞及組織失去了血液的營養(yǎng)供給，其營養(yǎng)主要依靠終板和纖維環(huán)的擴散方式來獲取，而隨著年齡的增加，椎體的終板逐漸出現鈣化甚至硬化，致使椎間盤的營養(yǎng)途徑被切斷，而導致椎間盤的退行性變。目前相關學者的主要研究方向集中在椎間盤退行性變的臨床治療方法，目前針對椎間盤退行性變的主要方案相關的保守治療以及不同方式的手術治療，保守治療包括相應的藥物治療、理療及臥床休息等，

4、僅能暫時起到緩解或部分緩解臨床癥狀的效果，在身體勞累或者其他應力改變的情況下，上述癥狀會再次出現，甚至加重。而隨著20世紀40年代，Jaslow和Clowoud等人將后路腰椎椎間融合術（Postive Lumbar Interbody Fusion PLIF）的方法引入臨床應用，臨床上開始應用減壓融合術來治療椎間盤退行性變，其可明顯的改善臨床癥狀，但改變了脊柱本身的應力結構，對鄰近階段以及整個脊柱的生物力學的影響，暫時并不十分確切，上述

5、方法雖能緩解或者部分緩解椎間盤退行性變引起的臨床癥狀，但均無法從根本上來治療椎間盤的退行性變。如何早期發(fā)現、并徹底治療椎間盤的退行性變逐漸成了學者們研究的熱點。隨著分子生物學的發(fā)展，學者們開始著手對椎間盤退行性變的機制上進行基礎研究，并有部分學者開始使用動物模型來模擬椎間盤退行性變進行基因治療，并獲得了可靠的療效。
　　目前研究的基因主要包括椎間盤結構相關基因（COLlAl基因、Sox9基因、COL9A2、COL9A3基因、COL

6、llA2基因、PG基因、CILP基因等）、骨質疏松相關基因（維生素D受體基因、雌激素受體基因）、椎間盤代謝相關基因（MMP-1、MMP3基因、TIMP-1、COX-2基因、TIMP-1和COX-2基因、THBS-2基因、ADH基因等）、細胞因子相關基因（炎癥相關基因、生長因子類基因等）以及信號傳導通路相關基因（GTP環(huán)化水解酶(GCHl)等）。而在這其中Sox9基因因其獨特的生物學作用成為研究的熱點。
　　Sox9基因在Sox基因

7、家族中占據著重要的地位，它主要調控著人以及脊椎動物的生長發(fā)育，在軟骨生成修復和決定性別方面起著決定作用。1994年，Foster等運用熒光原位雜交等技術，在染色體的17q24位上發(fā)現人類Sox9基因。Wagner等通過快速擴增cDNA末端結合人胚胎腦的cDNA文庫篩選的方法，成功分離和克隆了人類Sox9基因。
　　隨著分子生物學相關技術的發(fā)展以及對椎間盤退行性變機制研究的不斷深入，從越來越多的相關試驗證據中，學者們發(fā)現椎間盤的發(fā)育

8、、成熟到退變的整個變化過程均有Sox9基因的參與。如今，學者們對Sox9基因可促進Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖的生成以及細胞增殖的作用已十分明確，并對相關調控機制也有了很多了解。Gruber等收集了37例（年齡從15-76歲）人類椎間盤纖維環(huán)做Sox9基因的免疫組化染色，發(fā)現在年輕人的纖維環(huán)細胞中甚至髓核細胞中Sox9基因呈均勻染色，隨著年齡的增加以及椎間盤的退行性變，纖維環(huán)細胞中的Sox9基因染色逐漸的減少甚至消失。
　　已有學者研究

9、證實，在關節(jié)炎等相關疾病中高度表達的致炎因子可以明顯的抑制Sox9基因的生物學作用，從而減弱了病變軟骨的再生和修復能力，而在椎間盤退行性變過程中，Sox9基因的生物學作用是否也被抑制，從而使得退變的椎間盤難以自身修復，在椎間盤退行性變的過程中是否存在Sox9基因的點突變、調控方面的缺陷及為何會出現Sox9基因的表達降低等問題有待進一步地研究。故構建安全、可靠、有效的Sox9基因重組腺病毒載體對相關的研究十分必要，以往學者使用較多的AdE

10、asy系統進行腺病毒載體的構建，其在保存和產生效率方面均存在缺陷。而AdMax系統腺病毒包裝系統具有操作性簡便、病毒重組效率高、基因突變率低、病毒生產率高等優(yōu)勢，選用其構建相關Sox9基因的腺病毒載體，可為進一步研究Sox9基因在椎間盤退行性變中的作用及相關機制提供穩(wěn)定可靠的腺病毒載體。
　　應用構建的Sox9腺病毒載體感染所培養(yǎng)的人椎間盤髓核細胞，并觀察該細胞中Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的含量發(fā)生的變化，以徹底了解該基因對人椎間盤的

11、生物學效應。
　　目的：
　　應用AdMax包裝系統構建Sox9基因的腺病毒載體，并對其進行鑒定，為Sox9基因的相關研究提供可靠地腺病毒載體。將含Sox9基因的該腺病毒載體感染人椎間盤髓核細胞，了解其對人椎間盤細胞的生物學作用。
　　方法：
　　1.腺病毒載體建立法運用PCR方法對Sox9基因進行擴增，將擴增后的基因篩選后重組入線性化的pAV-MCMV-GFP-3FLAG，然后轉化入DH5a感受態(tài)細胞，得到轉化

12、子；運用菌落PCR技術對轉化子進行鑒定，鑒定完畢后，所得到的轉化子通過AdMax腺病毒包裝系統轉染入HEK293細胞，并在其中進行包裝成熟、擴增。
　　2.腺病毒載體的檢測方法應用Western Blot檢測法對Sox9基因重組腺病毒進行檢測，把建立的腺病毒載體的病毒DNA進行PCR鑒定、免疫熒光組化測定以及基因測序，并進行病毒滴度測定。
　　3.培養(yǎng)人退變椎間盤髓核細胞并感染鑒定好的Sox9基因載體，并通過免疫熒光染色了解

13、退變椎間盤髓核細胞的中Ⅱ型膠原蛋白的變化。
　　結果：
　　在以Sox9基因為模板PCR擴增得到的產物大?。?565bp，并經測序結果與Sox9基因對比分析，表明陽性克隆與Sox9基因一致，說明Sox9基因擴增成功。把獲得的病毒DNA進行PCR鑒定，得到1565bp片段，說明Sox9基因片段已經重組進入腺病毒。腺病毒的滴度為：2.3×1011PFU/ml。通過Western Blot檢測，在72-95KDa之間可以看到陽性條