腺相關(guān)病毒介導(dǎo)BMP-7和SOX9體外共同轉(zhuǎn)染人退變椎間盤生物學(xué)效應(yīng)的觀察.pdf

1、目的:構(gòu)建骨形成蛋白-7(BMP7)腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pAAV-hBMP7-IRESZsGreen和SOX9腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato并進(jìn)行腺相關(guān)病毒包裝,體外共同轉(zhuǎn)染人椎間盤細(xì)胞評(píng)價(jià)其生物學(xué)效應(yīng)。
　　 方法:用分子克隆技術(shù)從質(zhì)粒pUC57-hBMP-7獲得BMP-7cDNA并克隆至AAV包裝質(zhì)粒pAAV-IRES-ZsGreen上,構(gòu)建成pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen的

2、AAV重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后,由深圳百恩維公司對(duì)pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen進(jìn)行包裝;同法獲得SOX9過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato的包裝;AAV-BMP-7與AAV-SOX9聯(lián)合轉(zhuǎn)染人退變的椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞,Westernblotting檢測(cè)BMP-7與SOX9蛋白表達(dá)以及髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果:經(jīng)酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)AAV包裝質(zhì)粒pAAV-hBM

3、P7-IRES-ZsGreen與pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato構(gòu)建完成,熒光免疫組化顯示BMP-7與SOX9蛋白表達(dá),百思維公司包裝出具有生物學(xué)功能的AAV-BMP-7,AAV-SOX9構(gòu)建成功。Westernblotting顯示BMP-7與SOX9在纖維環(huán)細(xì)胞中表達(dá),AAV-BMP-7與AAV-SOX9雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染的纖維環(huán)細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)量明顯較AAV-BMP-7與AAV-SOX9基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)量多。<