重組腺病毒載體介導(dǎo)人乳鐵蛋白對(duì)宮頸癌干樣細(xì)胞增殖與凋亡的影響

1、中國(guó)組織工程研究 第 21 卷 第 13 期 2017–05–08 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research May 8, 2017 Vol.21, No.13ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

2、 2009·研究原著·www.CRTER.org張霞，女，1971 年生，漢族，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科相關(guān)研究。通訊作者：孟亞麗，主任醫(yī)師，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北省石家莊市050031 中圖分類號(hào):R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):2095-4344(2017)13-02009-06稿件接受：2017-03-22Zhang Xia, Master, Attending physician

3、, the First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, ChinaCorresponding author:Meng Ya-li, Chief physician, the First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Pro

4、vince, China重組腺病毒載體介導(dǎo)人乳鐵蛋白對(duì)宮頸癌干樣細(xì)胞增殖與凋亡的影響張 霞，都治香，王 娜，孟亞麗(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北省石家莊市 050031)引用本文：張霞，都治香，王娜，孟亞麗. 重組腺病毒載體介導(dǎo)人乳鐵蛋白對(duì)宮頸癌干樣細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].中國(guó)組織工程研究，2017，21(13):2009-2014.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.008 ORC

5、ID: 0000-0002-8398-3350(張霞)文章快速閱讀：文題釋義：宮頸癌干樣細(xì)胞：是指宮頸癌原代細(xì)胞中細(xì)胞可分化分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，可采用 SP 法進(jìn)行分選。重組腺病毒：重組腺病毒是從由侵染色斑組成單位(pfu)中分離獲得的。一個(gè)單色斑是線性載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后在20 cm×15 cm 板上由 293A 細(xì)胞連續(xù)侵染后被挑選和擴(kuò)增形成的。重組腺病毒可通過(guò)超速離心純化，并測(cè)定滴度及進(jìn)行 PCR 鑒定。摘要背景：基因工程

6、在人類治療惡性腫瘤的過(guò)程中起著重要作用，腺病毒是常用的基因工程載體，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中有著重要作用，但目前對(duì)于乳鐵蛋白通過(guò)腺病毒載體導(dǎo)入人體內(nèi)的表達(dá)情況的研究報(bào)道目前還比較少。目的：觀察重組腺病毒載體介導(dǎo)的人乳鐵蛋白對(duì)宮頸癌干樣細(xì)胞的增殖及凋亡的影響。方法：通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠宮頸癌原代細(xì)胞，采用 SP 法分選出宮頸癌干樣細(xì)胞，將構(gòu)建好的載有乳鐵蛋白的重組腺病毒載體人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)染于宮頸癌干樣細(xì)胞，分組為空白對(duì)照

7、組、空病毒組和重組腺病毒人乳鐵蛋白組。而在人乳鐵蛋白感染宮頸癌干樣細(xì)胞后，通過(guò) MTT 法檢測(cè)人乳鐵蛋白感染后宮頸癌干樣細(xì)胞的增殖情況，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌干樣細(xì)胞的遷移，通過(guò) Western blot 法檢測(cè)乳鐵蛋白在宮頸癌干樣細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，采用 Annexin V-FITC/PI 法測(cè)定宮頸癌干樣細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果與結(jié)論：與其他 2 組相比，重組腺病毒人乳鐵蛋白組宮頸癌干樣細(xì)胞增殖數(shù)量及劃痕處細(xì)胞的數(shù)目減少，凋亡細(xì)胞增加(P <

8、; 0.05 或 P < 0.01)。結(jié)果證實(shí)，載有乳鐵蛋白的重組腺病毒載體人乳鐵蛋白用于感染體外培養(yǎng)的宮頸癌干樣細(xì)胞后，能穩(wěn)定在宮頸癌干樣細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且能明顯抑制宮頸癌干樣細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。關(guān)鍵詞：干細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞；宮頸癌干樣細(xì)胞；乳鐵蛋白；宮頸癌；腺病毒；劃痕實(shí)驗(yàn)；最佳感染復(fù)數(shù)；增殖；凋亡；MTT；感染復(fù)數(shù)主題詞：干細(xì)胞；組織工程；細(xì)胞增殖基金資助：河北省 2014 年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(Z

9、D20140325)縮略語(yǔ)：重組腺病素介導(dǎo)的人乳鐵蛋白：adenovirus vector expressing human lactoferrin，Ad-hLFEffects of recombinant adenovirus vector expressing human lactoferrin on proliferation and apoptosis of cervical cancer stem-like cells Z

10、hang Xia, Du Zhi-xiang, Wang Na, Meng Ya-li (First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China)重組腺病毒載體介導(dǎo)人乳鐵蛋白(Ad-hLF)干預(yù)培養(yǎng)宮頸癌的干樣細(xì)胞重組腺病毒載體Ad-GFPAd-hLF重組腺病毒載體分離出來(lái)的宮頸癌細(xì)胞(1)劃痕試驗(yàn)；(2)Annexin

11、 V-FITC/PI法測(cè)定宮頸癌干樣細(xì)胞的凋亡；(3)Western blot 檢測(cè)hLF的表達(dá)；(4)MTT法檢測(cè)宮頸癌干樣細(xì)胞的增殖。培養(yǎng) 培養(yǎng)72 h后，收集細(xì) 后，收集細(xì)胞張霞，等. 重組腺病毒載體介導(dǎo)人乳鐵蛋白對(duì)宮頸癌干樣細(xì)胞增殖與凋亡的影響ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 2011www.CRTER.org355 nm。將分選出的宮頸癌干樣細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)。結(jié)果分

12、選出的干樣細(xì)胞約2×105個(gè)細(xì)胞，隨后在培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)72 h。1.4.3 腺病毒對(duì)宮頸癌干樣細(xì)胞的感染效率檢測(cè) 用對(duì)照組的空病毒Ad-GFP感染宮頸癌干樣細(xì)胞，以確定最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection，MOI)。取生長(zhǎng)良好的宮頸癌干樣細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液洗滌后，將細(xì)胞重懸，接種于24孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基。分別加入對(duì)照

13、組病毒液Ad-GFP，其MOI分別為25，50，75，100，200，各個(gè)組別均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后加入培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，用熒光倒置顯微鏡觀察能發(fā)射熒光的細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，熒光細(xì)胞數(shù)于細(xì)胞總數(shù)的百分比即為腺病毒對(duì)宮頸癌干樣細(xì)胞的感染效率。采用具有最佳感染效果的MOI數(shù)用于進(jìn)行宮頸癌干樣細(xì)胞感染，繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.4.4 MTT法檢測(cè)宮頸癌干樣細(xì)胞的增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的宮頸癌干樣細(xì)胞接種于24孔板

14、，每孔300 μL，細(xì)胞濃度為5×107 L-1，分別設(shè)空白對(duì)照組(1640完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng))、空病毒組(加入含病毒Ad-GFP的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng))和重組腺病毒Ad-hLF組(加入含病毒Ad-hLF的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng))，對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。分別于感染第24，36，48，72小時(shí)吸出每孔中的培養(yǎng)液，加入20 μL的MTT液(碧云天公司，上海)，孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄去上清液，每孔加入

15、DMSO 200 μL，在酶標(biāo)儀上于570 nm 處測(cè)定各孔吸光度值(A)，按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。1.4.5 Annexin V-FITC/PI法測(cè)定宮頸癌干樣細(xì)胞的凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的宮頸癌干樣細(xì)胞接種于24孔板，每孔 300 μL，細(xì)胞濃度為5×107 L-1，分別設(shè)空白對(duì)照組、空病毒空病毒組和重組腺病毒Ad-hLF組，對(duì)照組加入等體積的完全

16、培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。宮頸癌干樣細(xì)胞感染Ad-hLF 48 h后，胰蛋白酶消化，1 000×g離心10 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL。加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL PI混勻；暗室中室溫反應(yīng)15 min；然后用熒光顯微鏡觀察每200個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。1.4.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的宮頸癌干樣細(xì)

17、胞接種于24孔板，每孔300 μL，細(xì)胞濃度為5×107 L-1，分別設(shè)空白對(duì)照組、空病毒組和重組腺病毒Ad-hLF組，對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。在24孔板上用已滅菌的100 μL槍頭劃痕。用PBS洗細(xì)胞2次，去除刮起的細(xì)胞。感染Ad-hLF，24孔板中加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，0 h和24 h時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕的狀態(tài)。1.4.7 Western blot檢測(cè)

18、乳鐵蛋白表達(dá) Ad-hLF感染宮頸癌干樣細(xì)胞48 h后，當(dāng)細(xì)胞融合度約為80%時(shí)，將培養(yǎng)皿置于冰浴中，使用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞一兩次，經(jīng)胰蛋白酶消化，PBS洗滌后，當(dāng)70%-80%的細(xì)胞形態(tài)呈圓形或類圓形時(shí)用完全培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化，以1 000×g的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心5 min，小心棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液將細(xì)胞重懸，按BCA試劑盒說(shuō)明書，提取細(xì)胞總蛋白。根據(jù) Bradford方法測(cè)定總蛋白濃度，將符合要求的樣本蛋白用于

19、上樣，將樣本和上樣緩沖液混合均勻，煮沸 5 min，室溫冷卻后進(jìn)行上樣。于SDS-PAGE瓊脂凝膠上，進(jìn)行電泳，待條帶跑至底部即關(guān)閉電源停止電泳，小心取下凝膠，在轉(zhuǎn)移槽的陽(yáng)極板上按厚濾紙(經(jīng)緩沖液浸泡)、PVDF膜、凝膠、厚濾紙的順序放置，調(diào)節(jié)恒定電流2 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間約為2 h，將膠中的蛋白將轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜平放于小盒中用封閉液封閉，兔抗人乳鐵蛋白一抗用封閉液以1∶1 000稀釋后與PVDF膜在4 ℃中放置過(guò)夜，

20、PBST洗膜3次，二抗1∶2 000稀釋后與PVDF膜室溫條件下于搖床上結(jié)合1.5 h，PBST洗膜3次，小心將膜平放于儀器上，有蛋白的一面向上，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒參照說(shuō)明書的操作步驟，在化學(xué)熒光發(fā)光儀上進(jìn)行曝光顯像，并計(jì)算條帶相對(duì)灰度值。1.5 主要觀察指標(biāo) ①宮頸癌干樣細(xì)胞的增殖情況；②檢測(cè)宮頸癌干樣細(xì)胞的遷移；③宮頸癌干樣細(xì)胞內(nèi)乳鐵蛋白的表達(dá)；④宮頸癌干樣細(xì)胞的凋亡。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在SPS

21、S 19.0軟件中進(jìn)行。計(jì)量資料用 ±s表示，多組間數(shù)據(jù)差異的比較_ x采用重復(fù)測(cè)量方差分析或單因素方差分析法，P < 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 SP法從宮頸癌細(xì)胞中分選宮頸癌干樣細(xì)胞的鑒定結(jié)果 在宮頸癌原代細(xì)胞中采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，采用Hoechst 33342熒光染料進(jìn)行染色，可見(jiàn)多數(shù)細(xì)胞聚集在圖的中央及偏右部分，為非SP細(xì)胞，將其他部分對(duì)Hoechst 33342熒

22、光染料顯示陰性結(jié)果的細(xì)胞分選出來(lái)即為宮頸癌干樣細(xì)胞，見(jiàn)圖1。2.2 Ad-GFP對(duì)宮頸癌干樣細(xì)胞的感染效率 由表1可見(jiàn)，Ad-GFP對(duì)宮頸癌干樣細(xì)胞的感染效率隨著MOI的升高而增加，但在顯微鏡下觀察到當(dāng)MOI=200時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)較差，雖然感染率較高，但出現(xiàn)細(xì)胞脫落不貼壁的狀況，所以采用MOI=100在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中感染細(xì)胞。2.3 MTT法檢測(cè)各組宮頸癌干樣細(xì)胞增殖能力 由表2可見(jiàn)Ad-hLF感染宮頸癌干樣細(xì)胞后，培養(yǎng)24 h檢