重組腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)肝腫瘤細(xì)胞的干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：人肝細(xì)胞癌是世界范圍最高發(fā)的惡性腫瘤之一，亞洲和非洲尤其高發(fā)，估計(jì)每年有五十萬新發(fā)病人和一百萬死亡病人。肝癌的病因已經(jīng)研究得比較清楚，在中國主要是乙型病毒感染，近年來酒精性肝病有上升趨勢，另外黃曲霉素、糖尿病、代謝性肝病、體重過大等都是危險(xiǎn)因素。肝癌是多因素多步驟發(fā)病，涉及多個(gè)基因變異最終導(dǎo)致肝細(xì)胞惡變。由于肝癌致病原因多樣發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其確切分子機(jī)制至今尚不十分清楚。各種致病因子導(dǎo)致肝細(xì)胞反復(fù)受損、反復(fù)修復(fù)，可能導(dǎo)致基因變

2、異，例如細(xì)胞癌基因激活、抑癌基因失活、DNA配對(duì)錯(cuò)誤、染色體損傷、生長因子和血管生長因子過度表達(dá)等。肝癌與肝硬化關(guān)系密切，70—90﹪的肝癌病人有肝硬化。肝癌的治療可分為四類：外科治療(腫瘤切除和肝移植)，經(jīng)皮介入治療(乙醇注射、射頻熱剝蝕)，經(jīng)血管介入治療(栓塞、化學(xué)藥物灌注、化學(xué)藥物栓塞)和藥物治療(包括基因和免疫治療)。有望治愈腫瘤的方法包括腫瘤切除、肝移植和經(jīng)皮介入治療。經(jīng)過選擇的病人接受經(jīng)動(dòng)脈介入治療可提高部分病人的生存時(shí)間。

3、藥物治療和常規(guī)放射治療沒有明顯療效。外科治療方面，不合并肝硬化的肝癌病人接受手術(shù)切除是危險(xiǎn)性相對(duì)比較低，治療效果比較肯定的選擇，遺憾的是大多數(shù)病人合并肝硬化，切除范圍受到限制，切除范圍過大容易導(dǎo)致手術(shù)后肝衰竭。肝功能正常、腫瘤單發(fā)、無臨床癥狀的肝癌病人手術(shù)效果比較好，五年生存率可以達(dá)到70﹪。但是腫瘤成功切除五年后，有70﹪的病人硬化的肝臟可能再發(fā)生癌癥。肝移植應(yīng)該是治療肝癌比較有效的方法，能一次性切除腫瘤和硬化的肝臟，還能防止腫瘤復(fù)發(fā)

4、，但是如果腫瘤體積大或者多發(fā)則治療效果不佳，另外供肝來源不足也極大地限制了該方法的使用，該治療方法的推廣應(yīng)用還面臨著倫理、社會(huì)和法律等諸多問題。經(jīng)皮介入治療僅僅適用于瘤體比較小而且不能手術(shù)切除的肝癌病人，可通過乙醇注射、射頻或微波熱療激光熱療、及冷凍等方法進(jìn)行，使用范圍有限。經(jīng)動(dòng)脈栓塞或化學(xué)栓塞治療適用于既不能手術(shù)切除又不能通過經(jīng)皮途徑治療的肝癌病人。有15-50﹪的病人對(duì)該治療方法部分有效，與保守治療比較能延長病人生存時(shí)間，肝功能差的

5、病人無益處。總之傳統(tǒng)治療方法治療效果不十分理想，病人預(yù)后差。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展人們觀察到一些基因改變與肝癌有關(guān)，例如：p53變異、c-myc和cyclin D1過度表達(dá)，雜合性缺失(10ss of heterozygosity LOH)伴有腫瘤抑制基因失活，肝癌細(xì)胞中1p，4q，6q，8p，13q，16q and 17p位點(diǎn)經(jīng)常發(fā)生，另外幾個(gè)生長因子也與肝癌的發(fā)生有關(guān)，包括轉(zhuǎn)化生長因子a和B等。但是肝癌發(fā)生的分子機(jī)制尚不十分明了。

6、 近來有越來越多的證據(jù)表明表皮生長因子(EGFR)是有希望的腫瘤治療靶點(diǎn)，許多腫瘤顯示EGFR異常增強(qiáng)或結(jié)構(gòu)性EGFR表達(dá)。有報(bào)道人肝細(xì)胞癌EGFR表達(dá)，與腫瘤的侵襲性生長特性有關(guān)。尤其是低分化肝細(xì)胞癌．EGFR過表達(dá)，是預(yù)后不良的指標(biāo)，它與腫瘤早期復(fù)發(fā)和肝外轉(zhuǎn)移正相關(guān)。因此EGFR．是治療肝細(xì)胞癌新方法的有希望的靶點(diǎn)。 近幾年研究發(fā)現(xiàn)EGF/EGFR系統(tǒng)對(duì)肝細(xì)胞生長有強(qiáng)刺激作用。表皮生長因子受體(EGFR)是原癌基因erb

7、B-1的表達(dá)產(chǎn)物，屬I型跨膜酪氨酸激酶糖蛋白生長因子受體,分子量約為170KD。配體與EGFR結(jié)合后，啟動(dòng)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起下游一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要通過兩條途徑將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，～條是Ras→Raf→MAPK(有絲分裂原活化蛋白激酶)途徑，通過c-jun、c-fos將信號(hào)傳導(dǎo)至核內(nèi)激活A(yù)P．1；另一條是P13K(磷脂酰肌醇3激酶)→PKC→IKK途徑，使IkBα磷酸化后導(dǎo)致NF-KB移位至核內(nèi)，最終將胞外信號(hào)傳導(dǎo)至核內(nèi)，促使細(xì)胞增殖、

8、血管形成及抑制調(diào)亡，當(dāng)EGFR過度表達(dá)或表達(dá)失調(diào)時(shí)會(huì)導(dǎo)致腫瘤形成。研究顯示肝細(xì)胞癌常有EGFR過度表達(dá)或異常表達(dá)，抑制EGFR系統(tǒng)能抑制有EGFR表達(dá)的人肝癌細(xì)胞生長。目前，以EGFR為目標(biāo)的治療方略集中在細(xì)胞外配體結(jié)合部、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶和配體。 臨床前研究和臨床研究顯示多種單克隆抗體阻斷細(xì)胞外EGFR與其配體的結(jié)合，具有一定抗腫瘤作用。在第一代抗EGFR抗體Cetuximab剛剛經(jīng)過歐洲和美國使用核準(zhǔn)幾星期后，第二代抗EGF

9、R抗體已經(jīng)在澳大利亞進(jìn)入最初的臨床試驗(yàn)階段。兩篇發(fā)表于生物化學(xué)雜志的文章，提到這種新一代的EGFR抗體806，可以在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞上辨別EGFR分子。目前市面上已經(jīng)有一個(gè)抗EGFR抗體，更多的抗體正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。盡管這些抗EGFR抗體在患者體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤的活性，但是它們離理想還有一段距離，因?yàn)樗鼈兌鄶?shù)無法區(qū)別癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的EGFR。這些第一代抗體會(huì)造成副作用，因?yàn)樗鼈円舶颜５慕M織當(dāng)作攻擊目標(biāo)，雖然這些副作用是溫和的，但卻經(jīng)常

10、發(fā)生。更重要的是，第一代抗體的臨床應(yīng)用和能力均受到限制。806抗體的動(dòng)物研究顯示，它可以針對(duì)過度表達(dá)EGFR的癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。 Erlotinib是一種可口服的EGFR-TK活性抑制物，作用具有可逆性。Erlotinib的作用機(jī)制是競爭性抑制ATP與受體TK部位的結(jié)合，從而抑制EGFR的自動(dòng)磷酸化。FDA已經(jīng)批準(zhǔn)該藥為處方藥。有研究顯示Erlotinib導(dǎo)致的EGFR-TK抑制能通過誘導(dǎo)凋亡和使細(xì)胞周期停止在G1/S轉(zhuǎn)變期而

11、抑制人肝癌細(xì)胞生長。上述研究都是在EGFR形成后，再對(duì)其本身或配體與其結(jié)合后的下游過程進(jìn)行干預(yù)。其主要不足是不能減少EGFR的生成，抑制作用不完全、不持久。 RNAi是指由內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA(double strain ribose nucleic aciddsRNA)介導(dǎo)，并引起細(xì)胞內(nèi)同源靶基因表達(dá)沉默或抑制的效應(yīng)，這一現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默機(jī)制。在RNAi反應(yīng)過程中，雙鏈RNA被核糖核酶-Ⅲ(Dicer酶)切割為2

12、1～23個(gè)核苷酸長度的小干擾核糖核酸(small interference ribose nucleicacid siRNA)，siRNA再與含有核酸內(nèi)切酶的核酶復(fù)合物結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體RISC(ribose nucleic acid induced silence complex RISC)，進(jìn)而識(shí)別并和與siRNA具有完全互補(bǔ)序列的同源mRNA結(jié)合，將之裂解，引起基因沉默，從而特異高效率地抑制目的基因蛋白的表達(dá)。有研究表明

13、，帶有shRNA(小發(fā)夾RNA)表達(dá)框架的載體可以取得較高的RNA干擾效應(yīng)，然而其作為抗肝細(xì)胞癌藥物的潛能仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)的目的：1.用EGFR shRNA質(zhì)粒載體對(duì)HepG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)進(jìn)行體外RNA干擾實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證EGFR基因沉默效果。2.構(gòu)建表達(dá)EGFRshRNA重組腺病毒，評(píng)價(jià)它對(duì)HepG2細(xì)胞生長抑制的效果。 方法：1.用重組pSIREN-hERa質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，通過RT-PCR、WesternBlot

14、、MTT及流式細(xì)胞儀檢測其RNA干擾后細(xì)胞的EGFR蛋白、mRNA表達(dá)改變及細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖性能的變化，驗(yàn)證EGFR基因沉默效果。 2．將質(zhì)粒載體中的U6 shRNA表達(dá)框架切下，插入到腺病毒DNA載體中，構(gòu)建重組腺病毒載體(recombinant pAdeno-hER<'RNAi>DNA vector)，經(jīng)人胚腎293細(xì)胞包裝后獲得用于RNA干擾的重組腺病毒(Adeno-hER<'RNAi>virus)。通過Xho I酶切分

15、析及PCR分析，鑒定重組腺病毒是否含有插入的目的序列。用100 pfu/cell的重組腺病毒感染HepG2細(xì)胞，分析處理后細(xì)胞的生物學(xué)特征變化，評(píng)價(jià)重組腺病毒的RNA干擾效率。 結(jié)果：1．DNA序列測定結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒載體pSIREN-hERs構(gòu)建正確，插入序列位置正確。PCR及酶切鑒定結(jié)果，重組腺病毒含有目的插入序列。 2．重組質(zhì)粒pSIREN-hERa轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，RT-PCR，Westem．blot，MTT

16、及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：處理后細(xì)胞的EGFR mRNA、EGFR蛋白表達(dá)量下降，細(xì)胞增殖活性下降，細(xì)胞周期停滯及凋亡增加。 3．重組腺病毒pAdeno-hER<'RNAi> vires感染HepG2細(xì)胞后Real Time RT-PCR、Westem-blot及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：pAdeno-hER<'RNAi> virus處理后細(xì)胞的EGFR mRNA、EGFR蛋白表達(dá)量明顯下降，凋亡增加，其中重組腺病毒處理后細(xì)胞的E