版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei,簡(jiǎn)稱類鼻疽菌)是一種革蘭陰性桿菌,主要存在于水或土壤中,可經(jīng)由呼吸道吸入、消化道攝入、皮膚侵入等方式進(jìn)行傳播,主要侵犯人體肺部,可引起以肺炎、肺部空洞及肺部膿腫為特點(diǎn)的類鼻疽病,還可導(dǎo)致皮膚、腎臟、肝臟等多器官膿腫,嚴(yán)重者還可能發(fā)展為急性敗血癥而導(dǎo)致死亡。類鼻疽作為一種新發(fā)現(xiàn)傳染病,診斷困難、致病性強(qiáng)、臨床用藥治療困難,并且潛伏期較長(zhǎng),流行地區(qū)死亡率高達(dá)40%;其流
2、行區(qū)域主要分布在南、北緯二十度內(nèi),涵蓋新加坡、澳大利亞、越南、柬埔寨、馬來西亞、老撾、泰國(guó)東北部等地區(qū)以及我國(guó)香港、臺(tái)灣、廣東、海南等地區(qū),越來越多的證據(jù)表明它是一種正在全球擴(kuò)散的人獸共患傳染病,目前尚無(wú)批準(zhǔn)使用的有效類鼻疽疫苗,因此亟待加強(qiáng)類鼻疽的相關(guān)研究。
毒力因子在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮重要作用,類鼻疽菌的毒力因子主要有Ⅲ型分泌系統(tǒng)、Ⅵ型分泌系統(tǒng)、莢膜多糖、鞭毛、菌毛、群體感應(yīng)分子、脂多糖等。2011年被發(fā)現(xiàn)的類鼻疽伯克霍爾
3、德菌致死因子1(Burkholderia lethal factor1,BLF1),由bpsl1549基因編碼,結(jié)構(gòu)類似于大腸桿菌的細(xì)胞毒力因子CNF1-C,主要通過抑制eIF4A解旋酶的活性干擾蛋白質(zhì)的翻譯起始階段,引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改變,并最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。類鼻疽的死亡率較高,而BLF1作為類鼻疽菌第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的致死因子,其重要性不言而喻,獲取該毒素對(duì)研究其致病機(jī)制以及指導(dǎo)類鼻疽的診斷和防治具有重要意義。
近年來,
4、隨著蛋白合成抑制劑在抗腫瘤治療方面的效果逐漸被認(rèn)可,人們對(duì)蛋白質(zhì)翻譯起始因子eIF4A的抑制劑在靶向抗腫瘤治療中應(yīng)用的關(guān)注度也越來越高。BLF1作為潛在的eIF4A解旋酶活性抑制劑,能夠抑制蛋白質(zhì)的合成。那么可以設(shè)想,如果將該毒素遞送至腫瘤細(xì)胞后,毒素是否具有廣譜殺傷腫瘤細(xì)胞的作用呢?目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)的研究報(bào)道。
本研究的主要目的是通過基因工程技術(shù)重組表達(dá)BLF1(rBLF1)蛋白,并初步研究BLF1對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,為
5、該蛋白在抗腫瘤治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。
方法:
1.以BPC006菌株的全基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增bpsl1549基因,目的基因與pGEX-6P-2載體質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行BamHI/XhoI雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)回收、連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞,氨芐抗性LB平板篩選陽(yáng)性克隆,雙酶切及DNA測(cè)序驗(yàn)證。
2.IPTG誘導(dǎo)陽(yáng)性重組子表達(dá)GST-BLF1融合蛋白,親和層析純化融合蛋白并經(jīng)PSP酶酶切后獲
6、得rBLF1蛋白。以純化rBLF1蛋白免疫新西蘭兔,制備抗BLF1血清,并通過Western blot及ELISA法鑒定。
3.A549細(xì)胞模型中,通過CCK-8實(shí)驗(yàn)研究目的蛋白的細(xì)胞毒性效應(yīng)及抗體阻斷作用。不同濃度rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,觀察小鼠生存率。
結(jié)果:
1.從類鼻疽菌基因組DNA中PCR得到了編碼BLF1的目的基因,并通過pGEX-6P-2載體成功構(gòu)建了高效表達(dá)BLF1的工程菌株
7、。
2.經(jīng)過二步親和層析得到了分子量為23kD的高純度rBLF1,將純化蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清,ELISA效價(jià)達(dá)1∶1280000,Western blot鑒定在目的蛋白位置處出現(xiàn)特異印跡條帶。
3.rBLF1蛋白能明顯殺傷A549細(xì)胞,抗體可有效阻斷其殺傷作用。
4.rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,小鼠死亡率隨蛋白劑量的增加而升高,同時(shí)正常小鼠對(duì)低劑量BLF1表現(xiàn)出一定的耐受性。
結(jié)
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 類鼻疽桿菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)蛋白BPSS1395的重組表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf
- 單鏈TRAIL重組表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf
- 57133.??窠?jīng)毒素的基因克隆、重組表達(dá)、純化及生物學(xué)活性鑒定
- 金葡液有效成分鑒定及重組金葡菌腸毒素生物學(xué)活性研究.pdf
- 1、重組蓖麻毒素A鏈蛋白的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的測(cè)定2、芋螺毒素MⅦA基因的融合表達(dá)及其鎮(zhèn)痛活性的測(cè)定.pdf
- 一種骨橋蛋白小分子肽的重組表達(dá)與生物學(xué)活性研究.pdf
- SAC-TRAIL重組表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf
- 重組人腦利鈉肽表達(dá)及生物學(xué)活性測(cè)定.pdf
- 赤芍拮抗內(nèi)毒素活性物質(zhì)的分離及生物學(xué)活性研究.pdf
- 金葡菌腸毒素A基因及其突變體表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性研究.pdf
- 1、蓖麻毒素A鏈蛋白的表達(dá)、純化與生物學(xué)活性測(cè)定2、抗蓖麻毒素A鏈蛋白的單克隆抗體制備及生物學(xué)特性研究.pdf
- 牦牛重組干擾素表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf
- Aloferon-1抗菌肽串聯(lián)式重組表達(dá)及重組Alloferon-1生物學(xué)活性研究.pdf
- 重組人Dickkopf1蛋白的克隆、表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的初步測(cè)定.pdf
- 深海PAHs降解菌的多樣性分析及重要降解菌的分子生物學(xué)研究.pdf
- 分子生物學(xué)重要試題及答案
- 重組溶葡萄球菌蛋白的原核表達(dá)、純化及生物學(xué)活性研究.pdf
- 葡萄球菌腸毒素B的分子修飾及其生物學(xué)活性研究.pdf
- 重組人B7新型外毒素融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)、純化及其生物學(xué)活性的初步研究.pdf
- 人TRAIL分子胞外區(qū)的克隆、表達(dá)純化及生物學(xué)活性鑒定.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論