硒對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬損傷的抑制作用.pdf

1、目的：
　　當(dāng)前心血管疾病成為所有致死原因的首位，而心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)。通過研究血管內(nèi)皮功能來揭示心血管疾病的發(fā)病機(jī)制已成為重要的研究方法。線粒體自噬是當(dāng)前研究熱點，同型半胱氨酸（Hcy）已被證實是心血管疾病危險因子，同型半胱氨酸能否誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬值得探索?，F(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥（HHcy）患者常伴隨高銅（Cu）血癥，因此Hcy和Cu的聯(lián)合作用對內(nèi)皮細(xì)胞的影響值得探索。然而目前很多實驗

2、室所用血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代過多、分化嚴(yán)重，對實驗結(jié)果的說服性造成影響。本實驗通過提取原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，初步探索同型半胱氨酸聯(lián)合銅損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞線的機(jī)制，是否有粒體自噬參與，自噬是有利還是有害，而硒對可能發(fā)生的作用的干預(yù)作用。
　　方法：
　?、偬崛≡四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　從新生兒臍帶提取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　?、诓捎肕TT法，檢測不同濃度的Hcy、Cu、Se、Hcy+Cu及Hcy+Cu+Se對細(xì)胞增殖的影響。

3、
　　以硫酸銅溶液及亞硒酸鈉溶液為銅離子及Se的來源，實驗分為：（1）單純Hcy對細(xì)胞增殖的影響，Hcy濃度分別為10μM、20μM、40μM、100μM、200μM；（2）單純銅及單純硒對細(xì)胞增殖的影響，Cu濃度分別為10μM、20μM、30μM、40μM、50μMμM；Se濃度分別為0.4μM、1μM、2μM、5μM、10μM；（3）加銅是否加重Hcy抑制增殖作用，各組合濃度為Hcy40μM+Cu10μM、Hcy40μM+Cu

4、20μM、Hcy40μM+Cu30μM、Hcy40μM+Cu40μM、Hcy40μM+Cu50μM；Hcy及Cu的處理時間均為48小時。
　?、鄄捎肕TT法探索最適Se濃度。
　　通過方法②中我們發(fā)現(xiàn)Hcy從40μM開始對細(xì)胞增殖產(chǎn)生了明顯抑制，在該實驗Cu及Se的限定濃度范圍內(nèi)，單純加銅或單純加硒對細(xì)胞增殖無明顯影響，而在Hcy濃度為40μM時，加不同濃度的Cu加重了對細(xì)胞增殖的抑制作用。本實驗選取Hcy40μM+Cu40

5、μM作為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，通過加不同濃度硒來探討硒的作用。實驗分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM+Se0.4μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se1μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se5μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se10μM組。處理方法同②中。
　　④細(xì)胞流式技術(shù)檢測Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se處理組ROS含量，探討Se對ROS生成量的影響。<

6、br>　　采用DCFH-DA熒光探針、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測活性氧。分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組。
　?、菁?xì)胞流式技術(shù)檢測Hcy+Cu、Hcy+Cu+Se處理組線粒體膜電位
　　采用JC-1染料利用細(xì)胞流式技術(shù)檢測線粒體膜電位，實驗分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組。
　　⑥細(xì)胞流式技術(shù)檢測Hcy+Cu、H

7、cy+Cu+Se處理組細(xì)胞凋亡率
　　采用AnnexinV法檢測細(xì)胞凋亡率，實驗分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組。
　?、叩鞍酌庖哂≯E法檢測LC3、PINK1蛋白表達(dá)量，探討Hcy+Cu加重人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬的可能，以及Se的干預(yù)作用。
　　實驗分為正常對照組、Hcy40μM+Cu40μM組、Hcy40μM+Cu40μM+Se2μM組，Western-b

8、lot檢測LC3級PINK1蛋白表達(dá)，探討Hcu+Cu能否導(dǎo)致細(xì)胞自噬加重。
　　結(jié)果：
　?。?）成功提取原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　（2）40μM及以上的Hcy抑制細(xì)胞增殖，P<0.05，且隨Hcy濃度增加抑制作用提高，P<0.05。Hcy和Cu的聯(lián)合作用能加重細(xì)胞增殖的抑制作用。
　?。?）0.4μM到5μM的Se對Hcy+Cu所致細(xì)胞增殖抑制具有減輕作用，P<0.05；且硒的濃度為2μM時減輕抑制作用最明

9、顯，P<0.05。
　?。?）Hcy+Cu+Se組ROS含量較Hcy+Cu組低（P<0.05），但較ctrl組高(P<0.05)。
　　（5）Hcy+Cu+Se組膜電位較Hcy+Cu組高（P<0.05），但較ctrl組低(P<0.05)。
　?。?）Hcy+Cu+Se組凋亡率較Hcy+Cu組低（P<0.05），但較ctrl組高(P<0.05)。
　　（7）Hcy+Cu+Se組LC3II/LC3I灰度值較Hcy+C

10、u組低（P<0.05），但較ctrl組高(P<0.05)；Hcy+Cu+Se組PINK1灰度值較Hcy+Cu組低（P<0.05），但較ctrl組高(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　?、偻桶腚装彼釓?0μM濃度開始能抑制人臍靜脈內(nèi)皮增殖，同型半胱氨酸濃度越高，細(xì)胞增殖抑制越顯著；
　?、贑u加重了同型半胱氨酸抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖；
　　③硒能減輕Cu和同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，且較適合人臍靜脈