RAS--線粒體依賴的自噬對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、第一部分:高糖誘導臍靜脈內皮細胞損傷的功能研究
　　目的:
　　本研究主要探討不同葡萄糖濃度或者高葡萄糖濃度下不同作用時間對人臍靜脈內皮細胞衰老、自噬及凋亡的影響。
　　方法:
　　1.HUVEC在無血清ECM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時后，加入不同濃度葡萄糖(11，16.5，22，27.5，33mM)共同作用72h，或者33mM葡萄糖分別作用72，48，24，6h。ECM培養(yǎng)基基礎葡萄糖濃度5.5mM。同時給予33mM

2、甘露醇作為對照排除滲透壓升高的影響。
　　2.葡萄糖處理后，分別行細胞周期、β-半乳糖苷酶染色、細胞衰老相關異染色質聚集(SAHF)和衰老相關蛋白檢測評估細胞衰老。
　　3.葡萄糖處理后，檢測自噬標志蛋白及自噬啟動蛋白的表達，并分別給予AICAR、CC調控自噬啟動蛋白AMPK，評估葡萄糖對內皮細胞自噬的影響。
　　4.葡萄糖處理后，流式細胞術評估葡萄糖對內皮細胞凋亡的影響。
　　結果:
　　1.葡萄糖呈現(xiàn)濃

3、度及劑量依賴性地促進人臍靜脈內皮細胞衰老，且這種促進與滲透壓改變無關。
　　2.葡萄糖誘導自噬標志蛋白及自噬啟動蛋白的高表達，且獨立于滲透壓改變。抑制AMPK磷酸化反應可以廢除高糖誘導的自噬反應。
　　3.培養(yǎng)條件下，高糖對人臍靜脈內皮細胞凋亡無明顯影響。
　　結論:
　　本研究表明，高糖可以明顯促進內皮細胞衰老、自噬，但對內皮細胞凋亡無明顯影響。且內皮細胞損傷為滲透壓非依賴性。
　　第二部分:RAS-線粒

4、體損傷在高糖誘導的人臍靜脈內皮損傷中的作用研究
　　目的:
　　本研究探討RAS-線粒體損傷在高糖誘導人臍靜脈內皮損傷中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　1.葡萄糖處理后，檢測ACE1、AGTR1、AGTR2 mRNA和蛋白水平變化。
　　2.葡萄糖處理后，分別行線粒體膜電位、活性氧、NADPH、胞漿Ca2+、細胞色素C定位檢測評估線粒體功能。
　　3.在HUVEC中加入AngⅡ(1uM)作用72h，模擬

5、33mM葡萄糖作用72h對內皮細胞線粒體損傷、細胞衰老、細胞自噬的影響。
　　4.在HUVEC中分別加入Benazepril(1uM)、Losartan(10uM)作用6h后，與33mM葡萄糖共同孵育72h，檢測線粒體損傷、細胞衰老、細胞自噬。
　　5.應用CCCP直接誘導線粒體通透孔開放，觀察人臍靜脈內皮細胞衰老、自噬及凋亡反應。CCCP與Benazepril及Losartan共同孵育，觀察線粒體損傷、細胞凋亡、自噬及衰老

6、反應。
　　結果:
　　1.葡萄糖誘導ACE1、AGTR1 mRNA和蛋白的高表達，但對AGTR2的表達無明顯改變。
　　2.葡萄糖誘導線粒體膜電位降低、NADPH表達下降、活性氧表達增高、胞漿Ca2+超載、細胞色素C與線粒體解耦連。
　　3.AngⅡ作用72h模擬高糖誘導的線粒體損傷，內皮細胞衰老及自噬反應增加。
　　4.Benazepril或Losartan可以改善高糖誘導的線粒體損傷及內皮細胞損傷反應

7、。
　　5.線粒體通透孔完全開放可以誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡、自噬反應高表達。低劑量CCCP對內皮細胞凋亡無影響。
　　6.線粒體通透孔開放完全逆轉Benazepril及Losartan對內皮細胞的保護作用。
　　結論:
　　本研究結果表明，葡萄糖通過ACE1、AGTR1的激活誘導線粒體損傷，而線粒體損傷誘發(fā)人臍靜脈內皮細胞衰老、自噬及凋亡反應增強。
　　第三部分:自噬限制高糖誘導的內皮細胞衰老及凋亡

8、>　　目的:
　　本研究探討細胞自噬對高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞衰老和凋亡的影響，同時進一步研究其可能的作用機制。
　　方法:
　　1.在HUVEC中加入不同的自噬抑制劑（3-MA、CC）及自噬激動劑(AICAR、CCCP)后，觀察內皮細胞衰老、凋亡變化情況。
　　2.對自噬小體骨架分子LC3、beclin1分別行siRNA干擾，觀察內皮細胞衰老、凋亡。
　　3.3-MA分別與Benazepril及Losa

9、rtan共同孵育，觀察內皮細胞衰老、凋亡。
　　結果:
　　1.3-MA、CC加速高糖誘導的內皮細胞衰老、凋亡，AICAR、CCCP部分逆轉高糖誘導的內皮細胞衰老、凋亡。
　　2.LC3、beclin1 siRNA干擾促進高糖誘導的內皮細胞衰老，并誘導內皮細胞凋亡。
　　3.3-MA廢除Benazepril及Losartan誘導的衰老延遲，并誘導內皮細胞凋亡。
　　結論:
　　本研究表明，自噬限制高糖

10、誘導的人臍靜脈內皮細胞衰老及凋亡。
　　第四部分:糖尿病患者及糖尿病大鼠血管內皮中存在自噬標志物、衰老標志分子聚集和衰老細胞表達增加
　　目的:
　　本研究驗證自噬、衰老、凋亡在糖尿病患者及糖尿病大鼠動脈血管內皮中的表達情況，并觀察Benazepril及Losartan對糖尿病大鼠血管內皮功能的保護作用。
　　方法:
　　1.腹腔注射STZ誘導糖尿病大鼠模型，分別給予benazepril、 losartan

11、、生理鹽水每日灌胃，持續(xù)灌胃8周。
　　2.大鼠麻醉后，檢測內皮依賴性血管舒張功能及內皮非依賴性血管舒張功能。
　　3.免疫組化檢測糖尿病大鼠血管內皮中自噬標志蛋白的表達。
　　4.ELISA檢測糖尿病大鼠血管內皮SA-β-gal表達。
　　5.TUNEL檢測糖尿病大鼠血管內皮細胞凋亡。
　　6.Weastern blot檢測糖尿病患者動脈內皮細胞自噬、凋亡及衰老標志蛋白的表達。
　　結果:
　

12、　1.糖尿病大鼠動脈內皮依賴性血管舒張功能受損，內皮非依賴性血管舒張功能無明顯改變;血管內皮細胞自噬標志蛋白、SA-β-gal表達，TUNEL陽性細胞率上升。
　　2.benazepril、losartan可以改善糖尿病大鼠動脈內皮依賴性血管舒張功能受損，降低血管內皮細胞自噬標志蛋白、SA-β-gal表達，TUNEL陽性細胞率。
　　3.糖尿病患者血管內皮細胞自噬、凋亡及衰老標志蛋白的表達量增高。
　　結論: