同型半胱氨酸致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景與目的：同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是一種含硫氨基酸，體內(nèi)不能合成，只能來(lái)源于蛋氨酸的分解代謝，在體內(nèi)主要以蛋白結(jié)合形式存在。其生理作用主要是參與體內(nèi)一碳單位的代謝。目前公認(rèn)，體內(nèi)Hcy濃度升高是導(dǎo)致心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。因此，對(duì)同型半胱氨酸在各種心腦血管疾病發(fā)病機(jī)制中所發(fā)揮作用的深入研究具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。研究表明，Hcy對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用是其致病機(jī)制的始動(dòng)因素。但Hcy內(nèi)皮損傷機(jī)制的研

2、究沒(méi)有得出一個(gè)系統(tǒng)的有說(shuō)服力的結(jié)論。本次研究的主要目的是利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究的理論和技術(shù)，對(duì)Hcy作用后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行觀察和分析，尋找與Hcy作用相關(guān)的蛋白質(zhì)改變，更全面的了解Hcy所引起的細(xì)胞內(nèi)功能蛋白的變化，為Hcy致血管內(nèi)皮損傷機(jī)制的研究提供新的數(shù)據(jù)。 材料與方法：運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)Hcy作用后的HUVEC進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)；用凋亡相關(guān)基因芯片技術(shù)獲得Hcy作用后的HUVEC凋亡相關(guān)基因表達(dá)

3、譜，利用RT-PCR、WesternBlot對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，全面分析Hcy誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路；采用2DE-MS技術(shù)路線對(duì)Hcy作用下的HUVEC蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行研究，并運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Hcy作用后發(fā)生改變的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析和相互作用分析。 第1頁(yè)共148頁(yè)結(jié)果：Hcy作用后可檢測(cè)到凋亡細(xì)胞的存在，并且凋亡細(xì)胞數(shù)與Hcy濃度呈正相關(guān)；凋亡相關(guān)基因芯片檢測(cè)結(jié)果以及RT-PCR、Western-blot檢測(cè)結(jié)果表

4、明，Hcy可以誘導(dǎo)12種凋亡相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，分別是：ASC、Bcl-2、BFL1、Blk、caspase-9、FLIP、DAPK2、DFF40、HRK、LTA、LTB、RPA3，16種基因表達(dá)下調(diào)，分別是Apaf-1、Bak、caspase-6、caspase-7、caspase-8、DcR1、TNFR1、Fas/CD95、CD27、TRAIL、TNFSF12、TNFSF14、TNFSF9、P53、TRAF2、TRAF3。經(jīng)2DE-M

5、S蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析，共鑒定出27種蛋白質(zhì)表達(dá)水平在Hcy作用后發(fā)生改變，表達(dá)下降的有：calreticulinprecursor、tubulin、HnRNPK、ATPsynthasealphachain(mitochondrialprecursor)、Fascin、Keratin、Reticulocalbin1precursor、poly(rC)-bindingprotein2isoformα、calponin,acidicisofor

6、m、hnRNPA/B、spliceisoform2ofp07226tropomyosinbeta4chain、putativeRNA-bindingprotein3、inorganicpyrophosphatase、proteasomesubunitbetatype7precursor、phosphoglyceratemutase1、superoxidedismutase[Mn]、stathmin、prefoldinsubunit5、e

7、IF-5A和一個(gè)Unknown(proteinforMGC：5321)，表達(dá)升高的有：β-Actin、alphaenolase、Myo5C、peroxiredoxin 4、peroxiredoxin1、hypotheticalprotein，以及annexinⅪ。其中，AnnexinⅪ，UBA/UBX33.3，Unknown(proteinforMGC：5321)和一個(gè)hypotheticalprotein尚無(wú)相關(guān)功能研究報(bào)道。

8、經(jīng)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和相互作用分析發(fā)現(xiàn)，c-myc、ATP5A1、FSCN1、hnRNPK四個(gè)分子似乎是本次實(shí)驗(yàn)所獲得的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的結(jié)點(diǎn)。 結(jié)論：綜合凋亡相關(guān)基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究結(jié)果進(jìn)行分析，我們認(rèn)為，在Hcy的血管內(nèi)皮損傷機(jī)制中，以Hcy的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用為主要作用方式，并且主要是通過(guò)死亡受體通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。但由于目前2DE-MS技術(shù)路線本身的缺陷，主要是對(duì)微量蛋白檢出能力較低，影響了對(duì)Hcy作用