神經(jīng)母細(xì)胞瘤中Trks基因的表達(dá)及K252a對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用.pdf

1、前言：神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB)是兒童最常見的腫瘤之一，它起源于神經(jīng)嵴的交感神經(jīng)鏈?；颊卟∏轭A(yù)后評(píng)判部分取決于就診時(shí)患者的年齡及其腫瘤分期。NB腫瘤富有興趣的一個(gè)特征是某些嬰兒播散性腫瘤能夠在未經(jīng)治療的情況下自行消退。多數(shù)研究表明某些腫瘤標(biāo)記物可能和NB腫瘤的分期及其預(yù)后相關(guān)。目前認(rèn)為Trks原癌基因的表達(dá)在調(diào)節(jié)NB腫瘤的生物學(xué)特征方面具有重要性作用。 同源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(Neurotrophins，NTs)

2、家族包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4/5(NT-4/5)。人們近來已經(jīng)克隆出來三種酪氨酸激酶受體(Tyrosinekinaserceptors，Trks)基因，即TrkA、TrkB及TrkC基因各自分別編碼NGF、BDNF及NT-3的對(duì)應(yīng)性受體。NTs通過粘附和激活跨膜Trks受體激酶而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的作用。因此Trks受體激酶在調(diào)節(jié)正常和腫瘤神經(jīng)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)及分化

3、中具有相當(dāng)重要的作用。Trks激酶抑制劑作為NB腫瘤治療的探索正是基于此種假說，即NB腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)是通過NT/Trk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來維持腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。 為了評(píng)估NB腫瘤中Trks基因表達(dá)的狀況及其意義，我們分別采用免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，對(duì)NB腫瘤組織中這些受體激酶的表達(dá)水平進(jìn)行半定量檢測(cè)和評(píng)價(jià)，旨在探討這些Trks基因表達(dá)和NB腫瘤的分化成熟、腫瘤分期及預(yù)后評(píng)估的關(guān)系。我們認(rèn)為普通醫(yī)院的臨床實(shí)驗(yàn)室比較容易采

4、納這些方法以便開展對(duì)NB患者進(jìn)行分子和遺傳學(xué)的評(píng)價(jià)。此外，我們還研究了K252a在體外對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)的影響，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了初步性探討，為開展K252a類衍生物在NB移植模型中的抗腫瘤研究奠定了良好的工作基礎(chǔ)。 方法： 一、臨床部分 1、臨床資料：本組資料來源于我院自1997年至2003年已經(jīng)治療的40例患者的腫瘤組織，其中神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)34例、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤(GNB)2例及

5、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤(GN)4例。全部腫瘤患者均經(jīng)術(shù)后病理所證實(shí)。患者確診年齡為2月-14歲，平均年齡為3.2歲。根據(jù)Evans標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行NB的腫瘤分期，其中Ⅰ期5例、Ⅱ期6例、ⅣS期3例、Ⅲ期7例及Ⅳ期13例。 2、免疫組化：采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化染色技術(shù)對(duì)40例NB腫瘤組織中Trks受體激酶的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。本組全部腫瘤組織統(tǒng)一進(jìn)行Trks受體免疫組化染色的半定量分級(jí)。采用0-5的六級(jí)評(píng)定分類法：0級(jí)為組織沒有

6、染色；1級(jí)為組織微量染色；2級(jí)為偶見細(xì)胞染色；3級(jí)為細(xì)胞少量染色；4級(jí)為細(xì)胞大量染色；5級(jí)為細(xì)胞極強(qiáng)染色。每個(gè)切片中隨機(jī)選取10個(gè)區(qū)域，高倍鏡下觀察和評(píng)級(jí)，隨后計(jì)算這10個(gè)高倍視野區(qū)的平均分級(jí)值。 3、RT-PCR：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)對(duì)27例NB組織中Trks基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量檢測(cè)。本組全部NB組織中Trks基因的表達(dá)，通過密度分析法測(cè)定各種靶基因產(chǎn)物與內(nèi)參照基因產(chǎn)物β-actin的比值，半定量

7、分析這些靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。我們根據(jù)其比值差異的范圍而采用三級(jí)分類法：＜0.5為不表達(dá)，0.5-1.0為低表達(dá)，＞1.0為高表達(dá)。 二、基礎(chǔ)部分 1、細(xì)胞培養(yǎng)：人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞株經(jīng)過復(fù)蘇處理后，放置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃含有5％CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)以維持細(xì)胞生長(zhǎng)。 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體Lipofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)SY5Y細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將本組轉(zhuǎn)染pBPSTR1-

8、TrkA和pBPSTR1質(zhì)粒的細(xì)胞，分別命名為SY5Y-TrkA實(shí)驗(yàn)組和SY5Y-Vec空載體組，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則命名為SY5Y對(duì)照組。 3、TrkA基因表達(dá)的鑒定：采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中TrkAmRNA的表達(dá)水平，通過密度分析法檢測(cè)TrkA基因和內(nèi)參照β-actin基因產(chǎn)物的比值。 4、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：三組細(xì)胞株培養(yǎng)一周后，經(jīng)1.25％戊二醛固定及熒光染料Annexin-V染色，采用熒光顯微鏡在藍(lán)色激發(fā)光(波

9、長(zhǎng)488nM)下觀察并照相。 5、細(xì)胞存活分析：將三組細(xì)胞按照3×104個(gè)/孔接種于96孔板，孵化全程六天后分別收獲細(xì)胞，采用MTT技術(shù)按照標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)存活細(xì)胞數(shù)量。酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)550nM的吸光度值，DMSO處理的對(duì)照組的吸光度值按照100％計(jì)算，則實(shí)驗(yàn)管細(xì)胞增殖率(％)=實(shí)驗(yàn)管數(shù)值/對(duì)照管數(shù)值×100％。 結(jié)果： 一、臨床部分 1、Trks受體的表達(dá)與分化成熟：在NB小葉的較好組織結(jié)構(gòu)中，低分期組要較

10、高分期組的腫瘤組織具有更強(qiáng)的T~kA及TrkC受體表達(dá)的免疫組化染色反應(yīng)。TrkA及TrkC受體表達(dá)的染色反應(yīng)和分化成熟的程度呈現(xiàn)出向心性逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。全部2例GNB及4例GN標(biāo)本組織也都對(duì)TrkA及TrkC抗體呈現(xiàn)出明顯的強(qiáng)陽性染色反應(yīng)。全部標(biāo)本組織中僅見4例出現(xiàn)NB細(xì)胞對(duì)TrkB抗體的陽性染色反應(yīng)。 2、Trks受體表達(dá)的免疫組化分級(jí)：TrkA受體的免疫組化分級(jí)值在存活組與死亡組之間的比較具有顯著性差異(P＜0.01)，而

11、在低分期組與高分期組之間的比較也具有顯著性差異(P＜0.01)，但TrkB或TrkC受體的免疫組化分級(jí)值在上述各組之間的比較則均無顯著性差異(P＞0.05)。34例NB患者TrkA受體的免疫組化分級(jí)值伴隨著腫瘤分期的增高而呈現(xiàn)逐漸性降低的趨勢(shì)。 3、Trks基因mRNA的表達(dá)率：TrkA的高表達(dá)率及總表達(dá)率在低分期組均明顯大于高分期組(p＜0.05)，而其高表達(dá)水平與患者2年存活率之間具有明顯的相關(guān)性(p＜0.01)。TrkB的

12、高表達(dá)率及總表達(dá)率在高分期組均明顯大于低分期組(p＜0.05)。TrkC的表達(dá)通常伴有TrkA的表達(dá)，而這兩者的共同表達(dá)率在低分期組則明顯大于高分期組(p＜0.05)，但它們的表達(dá)之間并不存在著關(guān)聯(lián)性趨勢(shì)。 二、基礎(chǔ)部分 1、K252a對(duì)SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響：DMSO處理的SY5Y細(xì)胞可以保持均勻的扁片狀生長(zhǎng)。K252a處理的其它三組細(xì)胞中，SY5Y和SY5Y-Vec細(xì)胞均見胞體增大、聚集成簇團(tuán)狀且軸突明顯延伸，但SY

13、5Y-TrkA細(xì)胞則呈現(xiàn)散在性分布且胞體縮小及變形改變。 2、K252a對(duì)SY5Y細(xì)胞增殖的影響：將用DMSO處理的SY5Y對(duì)照組細(xì)胞的增殖率按100％計(jì)算，而經(jīng)K252a處理的其它三組細(xì)胞的增殖率則分別為：SY5Y細(xì)胞組為127±14，SY5Y-Vec空載體組為123±15，SY5Y-TrkA轉(zhuǎn)染組為65±8。除了SY5Y細(xì)胞組和SY5Y-Vec空載體組的均數(shù)比較無顯著性差異外，其它各組細(xì)胞的均數(shù)組間比較均有顯著性差異(P＜0

14、.01)。 結(jié)論： 1、采用免疫組化技術(shù)可以檢測(cè)NB組織中Trks受體蛋白的表達(dá)及NB細(xì)胞的分化成熟度。 2、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)可以半定量檢測(cè)NB組織中Trks基因mRNA的表達(dá)。 3、Trks基因的表達(dá)對(duì)NB患者的腫瘤分期及其預(yù)后評(píng)轱可能具有重要性價(jià)值。 4、K252a能夠促進(jìn)不表達(dá)TrkA基因的SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)及其分化。 5、K252a能夠抑制表達(dá)TrkA基因的SY5Y-Tr