組織因子調(diào)控阿霉素誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：研究組織因子(TF)對化療藥物誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響及其機制。
　　 方法：以Western Blotting檢測TF表達，以WST法檢測阿霉素的細(xì)胞毒性。以 Western Blotting檢測阿霉素誘導(dǎo)的Caspase-3、PARP的裂解。
　　 結(jié)果：人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U373MG高表達TF而 LN-229細(xì)胞系中TF表達水平低；阿霉素的細(xì)胞毒性在U373MG中較弱而在LN

2、-229中較強。 以TF-pcDNA3真核表達載體轉(zhuǎn)染低表達TF的LN-229細(xì)胞，TF表達水平呈劑量依賴性增強。轉(zhuǎn)染TF的LN-229細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3的對照細(xì)胞分別以阿霉素處理16h、24h、48h，可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞較對照細(xì)胞Caspase-3、PARP的裂解延遲出現(xiàn)。以不同濃度阿霉素處理48h后，可見轉(zhuǎn)染TF的LN-229細(xì)胞的存活數(shù)較對照細(xì)胞明顯增多。Akt在U373MG中呈強活化，而LN-229中活化水平低。以FVII與

3、轉(zhuǎn)染TF的LN-229細(xì)胞作用，可觀察到Akt的顯著激活，呈時間依賴性。
　　 結(jié)論：人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TF的異常高表達可抑制阿霉素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，此效應(yīng)可能與TF與FVII相互作用后對下游PI3K/Akt信號的激活有關(guān)。TF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對阿霉素誘導(dǎo)凋亡的抑制作用可能影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性和疾病進展。
　　 第二部分
　　 目的：構(gòu)建組織因子(TF)特異性干擾RNA表達載體，抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞TF

4、表達。
　　 方法：分子生物學(xué)方法構(gòu)建TFsiRNA-pSUPER表達載體，限制酶切予以初步篩選，基因測序進行證實。以脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U373MG。以Western Blotting檢測TF表達。
　　 結(jié)果：所構(gòu)建TFsiRNA-pSUPER表達載體經(jīng)基因測序證實。U373MG細(xì)胞高表達TF，TFsiRNA-pSUPER表達載體轉(zhuǎn)染48h后，TF表達水平與轉(zhuǎn)染pSUP

5、ER質(zhì)粒的對照細(xì)胞相比顯著降低，呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論：人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U373MG 中TF異常高表達，本研究構(gòu)建的TFsiRNA表達載體可在U373MG 中特異性下調(diào)TF表達，可作為干預(yù)TF表達、研究其非凝血功能的有效手段。
　　 第三部分
　　 目的：研究組織因子(TF)表達下調(diào)對阿霉素誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：以Western印跡法檢測TF表達。分子生物學(xué)方法構(gòu)建TFsiRN

6、A-pSUPER表達載體，以脂質(zhì)體介導(dǎo)進行基因轉(zhuǎn)染。以WST法檢測阿霉素細(xì)胞毒性。以 Western印跡法檢測阿霉素誘導(dǎo)的Caspase-3、PARP的裂解。以Hochest33342染色，熒光顯微鏡下檢測凋亡細(xì)胞。
　　 結(jié)果：①人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U373MG 高表達TF；②構(gòu)建TFsiRNA-pSUPER表達載體，以之轉(zhuǎn)染高表達TF的U373MG 細(xì)胞，TF表達水平呈劑量依賴性降低；③轉(zhuǎn)染TFsiRNA-pSUPER的U3

7、73MG 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pSUPER質(zhì)粒的對照細(xì)胞分別以不同濃度阿霉素處理48h，前者與后者相比存活細(xì)胞數(shù)顯著降低；④轉(zhuǎn)染TFsiRNA-pSUPER的U373MG 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pSUPER質(zhì)粒的對照細(xì)胞分別以阿霉素處理4h、8h，可見前者較后者Caspase-3、PARP裂解增強；⑤以Hochest33342染色檢測到轉(zhuǎn)染TFsiRNA-pSUPER的U373MG 細(xì)胞與對照細(xì)胞相比，經(jīng)阿霉素處理后的凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)。