神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化研究.pdf

1、目的：腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥密切相關(guān)，該假說(shuō)提出以后，腫瘤干細(xì)胞的分離和純化成為研究的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)體外特定的無(wú)血清條件下培養(yǎng)原代腫瘤細(xì)胞，能形成富集腫瘤干細(xì)胞的腫瘤球，從而達(dá)到初步分離和純化腫瘤干細(xì)胞的目的。本研究旨在建立體外懸浮培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤球的方法，并證實(shí)腫瘤球中富含腫瘤干細(xì)胞。高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）病人經(jīng)誘導(dǎo)

2、化療和清髓性鞏固治療后大部分會(huì)復(fù)發(fā)，很可能與存在含有腫瘤干細(xì)胞的微小殘留病灶有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外觀察并鑒定13-順維甲酸能誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞分化，為臨床用13-順維甲酸治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：在特定的無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤原代腫瘤細(xì)胞，建立體外懸浮培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤球的方法；將細(xì)胞懸液濾過(guò)篩網(wǎng)，分離得到神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤球；用RT-PCR法比較成球細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞中干細(xì)胞基因Oct-4和

3、Bmi-1的表達(dá)差異；通過(guò)單克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成球細(xì)胞的單克隆形成能力和腫瘤球形成能力；用裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證腫瘤球細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力；在添加5uM 13-順維甲酸分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤球細(xì)胞，觀察誘導(dǎo)分化過(guò)程中成球細(xì)胞的形態(tài)演變，RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)過(guò)程中干細(xì)胞標(biāo)記 Oct-4 表達(dá)的變化，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)分化前后神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記 nestin 的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天后

4、形成懸浮腫瘤球； RT-PCR結(jié)果證實(shí)腫瘤球細(xì)胞較原代神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞基因 Oct-4 和 Bmi-1；部分來(lái)自腫瘤球的單個(gè)細(xì)胞能再次分裂增殖為單克隆腫瘤球，克隆形成率和單克隆腫瘤球形成率分別為55.3％和26.3％；1×104個(gè)腫瘤球細(xì)胞14d后形成裸鼠腋下移植瘤，而且成球細(xì)胞能高效連續(xù)成瘤；13-順維甲酸誘導(dǎo)分化過(guò)程中，成球細(xì)胞的形態(tài)逐漸趨向神經(jīng)元，RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的成球細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記 Oct-4 的表達(dá)降低，細(xì)胞