轉(zhuǎn)錄因子FOXO3表達(dá)抑制對(duì)人胚胎干細(xì)胞心肌定向分化的影響.pdf

1、背景：心衰，是世界上致死的主要疾病之一。隨著我國人民生活水平的提高及人口老齡化，心血管疾病發(fā)病率持續(xù)升高。隨著干細(xì)胞研究的深入，尤其是基于干細(xì)胞療法的研究進(jìn)展，使人為替換病損心肌根治心衰成為可能。然而，經(jīng)過10多年來臨床前研究和臨床研究的努力，由于缺乏對(duì)心肌分化的分子調(diào)控機(jī)制的足夠了解，細(xì)胞療法仍然不能夠作為常規(guī)療法用于心衰病人。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究顯示FOXO家族成員對(duì)小鼠的心臟發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，但尚無其參與人心臟發(fā)育調(diào)控的直接證據(jù)。

2、我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO3在人心肌分化過程中表達(dá)升高且處于轉(zhuǎn)錄活化狀態(tài)。因此推測FOXO3在人胚胎干細(xì)胞向心肌定向分化過程中起到一定的調(diào)控作用。
　　目的：通過觀察FOXO3敲低人胚胎干細(xì)胞系向心肌細(xì)胞分化過程中中胚層及心肌分化特異性標(biāo)記基因NKX2.5、ISL-1、TBX5、TBX20、Myocardin、Troponin T等的表達(dá)變化，觀察FOXO3基因表達(dá)的改變對(duì)人心肌細(xì)胞分化的進(jìn)程及效率的影響，證實(shí)FOXO3在人胚胎

3、干細(xì)胞向心肌定向分化過程中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.利用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)（shRNA）建立FOXO3敲低的HES2人胚胎干細(xì)胞系。
　　2.通過蛋白免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測FOXO3敲低的HES2細(xì)胞中FOXO3基因表達(dá)情況。
　　3.通過堿性磷酸酶染色、細(xì)胞免疫熒光染色、蛋白免疫印跡及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)檢測FOXO3敲低HES2細(xì)胞多能性特異性標(biāo)記物的表達(dá)情況，觀察FOX

4、O3表達(dá)抑制對(duì)人胚胎干細(xì)胞多能性的影響。
　　4.采用無血清培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，在心肌細(xì)胞分化的不同時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞中胚層及心肌分化特異性標(biāo)記基因的表達(dá)情況，觀察FOXO3表達(dá)抑制對(duì)心肌細(xì)胞分化的影響。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化末期各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中特異性標(biāo)記肌鈣蛋白T（TroponinT）陽性的細(xì)胞比例。
　　結(jié)果：
　　1.包裝制備表達(dá)FOXO3特異性shRNA的慢病毒，感染HES

5、2細(xì)胞并篩選獲得了GFP+/ZEOCIN抗性克隆。
　　2.在篩選得到的GFP+/ZEOCIN抗性HES2細(xì)胞中，內(nèi)源性FOXO3的表達(dá)在mRNA水平及蛋白水平均被抑制。
　　3.內(nèi)源性FOXO3表達(dá)的抑制并未改變?nèi)伺咛ジ杉?xì)胞多能性標(biāo)志物的表達(dá)水平。
　　4.FOXO3表達(dá)的抑制影響了人胚胎干細(xì)胞向心肌分化過程中的某些心肌分化特異性標(biāo)記基因的表達(dá)。
　　5.FOXO3表達(dá)的抑制使人胚胎干細(xì)胞向心肌分化末期心肌特異