長鏈非編碼RNAMEG3通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡.pdf

1、目的：構(gòu)建Lnc RNA MEG3真核表達載體pcDNA3.1-MEG3，建立MEG3穩(wěn)定表達細胞系，探討Lnc RNA MEG3對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響及機制。
　　方法：從人乳腺組織中用MEG3特異性引物通過RT-PCR的方法擴增人MEG3片段，將MEG3片段插入到載體pcDNA3.1中，構(gòu)建成Lnc RNA MEG3真核表達載體pcDNA3.1-MEG3，用PCR、酶切分析及測序鑒定的方法檢測經(jīng)過篩選之后得到的陽性重

2、組體pcDNA3.1-MEG3，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，經(jīng)G418篩選并擴增出陽性克隆后，用RT-PCR鑒定其在真核細胞中的表達；用MTT檢測MEG3對MCF-7細胞增殖活性的影響，用Hoechst33258染色法、流式細胞術(shù)檢測MEG3對MCF-7細胞凋亡的影響；在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MEG3的MCF-7細胞中加入NF-κB信號通路激動劑TNFα以及Bcl-2抑制劑TW37處理，用Western blot檢測MEG3對NF-κBP65、N

3、F-κB P50、Bcl-2和Caspase3蛋白的影響，分析NF-κBP65與NF-κB P50核移位的變化情況。
　　結(jié)果：一個分子大小約為1600bp的片段從人乳腺組織中被擴增出來，經(jīng)過限制性雙酶切、鏈接獲得重組子pcDNA3.1-MEG3，瓊脂糖凝膠電泳顯示重組子中插入片段為1600bp左右，與預(yù)期MEG3分子大小相符；對重組質(zhì)粒進行DNA的測序，結(jié)果顯示插入質(zhì)粒的MEG3的核酸序列正確無誤，無讀碼框移位現(xiàn)象；用脂質(zhì)體將重

4、組pcDNA3.1-MEG3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，獲得重組的MCF-7細胞，RT-PCR結(jié)果顯示MEG3在MCF-7細胞中穩(wěn)定表達；MTT法結(jié)果顯示：與MCF-7細胞（MCF-7細胞）和轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7細胞（MCF-7-C細胞）比較，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MEG3的MCF-7細胞（MCF-7-M細胞）增殖活性降低（p<0.01)，NF-κB激動劑TNFα預(yù)處理，MCF-7-M細胞增殖活性增強（p<0.01)，用NF-κB激動劑TNFα和Bcl

5、-2抑制劑TW37聯(lián)合預(yù)處理的MCF-7-M細胞比單用TNFα處理的MCF-7-M細胞增殖活性降低（p<0.01)；Hoechst33258染色法和流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與MCF-7細胞組和MCF-7-C細胞組相比，MCF-7-M細胞組凋亡率明顯升高（p<0.01），TNFα預(yù)處理的MCF-7-M細胞比MCF-7-M細胞的細胞凋亡率明顯降低（p<0.01），TNFα+TW37聯(lián)合預(yù)處理的MCF-7-M細胞比單用TNFα處理的MCF-7

6、-M細胞的凋亡率明顯升高（p<0.01）；蛋白跡法結(jié)果顯示：MCF-7-M細胞I-κBα磷酸化水平降低（p<0.05），TNFα誘導(dǎo)MCF-7-M細胞I-κBα蛋白磷酸化。MCF-7-M細胞NF-κBP65、NF-κB P50以及Bcl-2蛋白表達明顯降低（p<0.01），Caspase3蛋白表達明顯升高（p<0.01），TNFα可誘導(dǎo)MCF-7-M細胞NF-κBP65、NF-κB P50和Bcl-2蛋白的表達，促進NF-κBP65、N

7、F-κB P50的核轉(zhuǎn)位，抑制Caspase3蛋白的表達，TW37可抑制MCF-7-M細胞Bcl-2蛋白的表達，誘導(dǎo)Caspase3蛋白的表達。
　　結(jié)論：
　?。?）成功構(gòu)建了MEG3真核表達載體pcDNA3.1-MEG3，建立了MEG3穩(wěn)定表達細胞系——MCF-7-M細胞。
　?。?）Lnc RNA MEG3通過抑制MCF-7細胞I-κBα蛋白的磷酸化和NF-κBP65、NF-κB P50的核轉(zhuǎn)位，下調(diào)MCF-7細