ClC-3通過NF-κB信號通路調(diào)控P-gp介導腫瘤細胞耐藥的研究.pdf

1、目的：
　　研究ClC-3(voltage-gated chloride channel3)氯通道蛋白調(diào)控P-糖蛋白（P-glycoprotein。P-gp）介導腫瘤細胞耐藥的分子機制，確定ClC-3是通過NF-кB信號通路來調(diào)控P-gp的表達，為進一步研究ClC-3在腫瘤中的作用以及基于逆轉腫瘤耐藥的腫瘤治療提供靶點及理論依據(jù)。
　　方法：
　?、賅estern blot檢測人乳腺癌細胞株MCF-7及其阿霉素耐藥株M

2、CF-7/ADR中NF-кB P65、IкBα、IKKα、IKKβ的表達。② MCF-7細胞轉染ClC-3表達質粒
　?。╬cDNA3.1/ClC-3）增強ClC-3的表達，Western blot檢測過表達ClC-3后的細胞NF-кB P65、IкBα、pIкBα/ser32、IKKα、IKKβ的表達。③細胞免疫熒光檢測MCF-7細胞的ClC-3表達增加后對NF-кB P65核轉移的影響。④雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)
　　（p

3、-NF-κB-luc和pRL-TK-Vector）檢測 MCF-7細胞的ClC-3表達增加后對NF-κB轉錄活性水平的影響。⑤MCF-7細胞用脂多糖LPS刺激或轉染P65 SiRNA后，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測NF-κB轉錄活性水平，熒光定量PCR和Western blot檢測NF-κB轉錄活性改變對MDR1 mRNA和P-gp表達的影響。⑥ MCF-7細胞 ClC-3表達增加后，再轉染P65 SiRNA抑制NF-κB信號通路，熒光定

4、量PCR和Western blot檢測對MDR1 mRNA和P-gp表達的影響。⑦MCF-7細胞上調(diào)ClC-3表達后再抑制NF-κB信號通路（轉染P65 Si RNA），MTT法檢測抗癌藥物紫杉醇對干預后細胞增殖的影響。
　　結果：
　?、?MCF-7/ADR細胞的IKKα、IKKβ、NF-кB P65蛋白表達量明顯高于MCF-7細胞。IкBα表達量則降低。②上調(diào)MCF-7細胞ClC-3的表達量，其IKKα、IKKβ、NF-

5、кBP65、pIкBα/ser32蛋白表達量明顯增加。③上調(diào)MCF-7細胞ClC-3的表達量后，NF-кB P65蛋白從細胞質基質中轉移到細胞核中。④ ClC-3能作用于NF-кB P65靶位點，轉染后增加NF-кB P65相對螢光素酶值，提高轉錄活性水平。⑤ LPS激活MCF-7細胞NF-κB信號通路，上調(diào)MDR1 mRNA和P-gp的表達；P65 Si RNA抑制NF-κB信號通路，下調(diào)MDR1 mRNA和P-gp的表達。⑥增加MC