雷公藤對糖尿病肝臟損傷的作用和機制研究.pdf

1、目的：
　　肝臟調節(jié)體內糖、脂肪、蛋白質的代謝，對于2型糖尿病的發(fā)生和進展至關重要。糖尿病肝臟損傷主要表現為肝內脂肪浸潤導致非酒精性脂肪性肝病，由于發(fā)病機制目前尚未完全闡明，因此并無特異性治療藥物或手段。肝臟是重要的天然免疫器官，也是炎癥介導的主要靶器官，免疫和炎癥在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、發(fā)展過程中作用不容忽視。傳統(tǒng)中藥—雷公藤具有強大的抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抑制免疫等藥理活性，雷公藤紅素是雷公藤的主要活性單體，其藥理活性顯著

2、而廣泛。目前為止，國內外均未見關于雷公藤制劑對糖尿病肝臟損傷的作用研究。本課題從動物整體水平和細胞水平，評價雷公藤對糖尿病脂肪性肝臟損傷的作用，并應用RNA干擾技術特異性沉默致病基因，旨在進一步探討雷公藤可能的作用機制。
　　方法：
　　1.體內研究：Sprague-Dawley大鼠75只，雄性清潔級，隨機選取15只作為正常對照組（NC組，n=15）予標準飼料喂養(yǎng)，其余60只大鼠予高脂高糖飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后尾靜脈注射鏈脲佐

3、菌素30mg/kg誘導2型糖尿病大鼠模型。成模大鼠隨機分為4組：糖尿病模型組（DM組）、雷公藤多苷低劑量干預組（DM+TL組，1mg/kgd）、雷公藤多苷中劑量干預組（DM+TM組，3mg/kgd）和雷公藤多苷高劑量干預組（DM+TH組，6mg/kgd）。干預8周后處死取材，檢測血糖、肝腎功能、血脂、血常規(guī)等生化指標，測量大鼠體重（BW）、肝重（LW），計算肝指數；hematoxylin-eosin及Masson染色光學顯微鏡下觀察各組

4、大鼠肝組織病理形態(tài)的改變；ELISA法檢測各組大鼠血清炎癥因子NF-κB，IL-1β和TNFα水平；應用免疫組織化學技術、RT-PCR和Western Blotting技術觀察各組大鼠肝組織TLR4，MyD88，NF-κB，p-IκBα及下游炎癥因子IL-1β和TNFα基因和蛋白的表達。
　　2.體外研究：游離脂肪酸（FFAs，棕櫚酸：油酸=1:2）誘導人源肝癌細胞株（HepG2細胞）脂肪變性，油紅O染色觀察細胞脂質沉積情況；應用

5、CCK8法檢測細胞生存率。體外化學合成TLR4 siRNA，應用RNA干擾技術轉染HepG2細胞株，并篩選有效基因沉默序列。實驗分為7組：正常對照組、FFAs組、FFAs+陰性空轉組、FFAs+TLR4 siRNA組、FFAs+雷公藤紅素組、FFAs+雷公藤紅素+陰性空轉組、FFAs+雷公藤紅素+TLR4 siRNA組。RT-PCR和Western Blotting技術從蛋白水平和基因水平檢測各組HepG2細胞TLR4，MyD88，NF

6、-κB及下游炎癥因子IL-1β和TNFα表達。
　　結果：
　　1.體內研究：
　　（1）造模結果：高脂高糖喂養(yǎng)8周后大鼠血脂、胰島素水平和胰島素抵抗指數HOMA-IR、胰島素分泌指數HOMA-β均較常規(guī)喂養(yǎng)組明顯升高（P＜0.05），說明出現胰島素抵抗和高胰島素血癥；尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素后，高脂組大鼠血糖明顯升高，出現典型“三多一少”癥狀，提示2型糖尿病大鼠模型制備成功。
　?。?）一般指標：
　　

7、①生化指標：與NC組相比，DM組和雷公藤多苷不同劑量干預組大鼠血糖、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）均明顯升高（P＜0.05）；與DM組相比，雷公藤多苷不同劑量干預組大鼠血糖、TC和TG無明顯改變（P＞0.05）。各組大鼠間肝、腎功能和血常規(guī)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　②體重、肝指數（LW/BW）：與NC組相比，DM組和雷公藤多苷不同劑量干預組大鼠體重明顯降低（P＜0.05）；DM組和雷公藤多苷不同劑量干預組間大鼠體重

8、無明顯差異（P＞0.05）。與NC組相比，DM組大鼠LW/BW明顯升高（P＜0.05），DM+TH組LW/BW低于DM組（P＜0.05），但仍高于NC組（P＜0.05）。
　?。?）雷公藤多苷對糖尿病大鼠肝組織病理形態(tài)學的影響：光鏡下H&E染色顯示，NC組大鼠肝小葉結構完整、清晰，肝細胞大小形態(tài)正常，無炎性細胞浸潤；DM組肝小葉結構輪廓大致消失，肝細胞排列紊亂，腫脹呈彌漫性大泡樣脂肪變性，匯管區(qū)可見炎性細胞浸潤；雷公藤多苷干預組有

9、不同程度減輕，DM+TH組改善最明顯。Masson染色顯示，NC組大鼠無明顯纖維組織增生，DM大鼠可見門脈區(qū)少量纖維組織增生，雷公藤多苷各干預組有不同程度減輕。
　?。?）雷公藤多苷對糖尿病大鼠血清中炎性介質水平的影響：與NC組相比， DM組大鼠血清NF-κB、IL-1β和TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）；與DM組相比，雷公藤多苷各干預組大鼠血清各因子水平有不同程度降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。
　?。?）雷公藤

10、多苷對糖尿病大鼠肝組織TLR4/MyD88/NF-κB免疫炎癥信號通路的影響：與NC組相比，DM組大鼠肝組織TLR4，MyD88，NF-κB，p-IκBα和下游炎癥因子 IL-1β，TNF-α mRNA和蛋白表達均明顯增加（P＜0.05）；與DM組相比，雷公藤多苷各干預組各因子mRNA和蛋白表達呈現劑量依賴性降低（P＜0.05）。
　　2.體外研究：
　　（1）最佳FFAs濃度篩選：HepG2細胞給予0.5mM FFAs呈現

11、明顯脂肪變性，且與正常對照組相比，不影響細胞活力（P＞0.05）。因此，確定0.5mM FFAs為最佳誘導濃度。
　?。?）最佳雷公藤紅素濃度篩選：脂肪變性的HepG2細胞給予0.5μM雷公藤紅素可見紅色脂滴顯著減少，與對照組相比，不影響細胞活力（P＞0.05）。因此，確定0.5μM雷公藤紅素為最佳干預濃度。
　?。?）熒光顯微鏡和流式細胞術檢測轉染效率：脂質體轉染TLR4 siRNA24小時后，熒光顯微鏡下細胞分布處胞漿均

12、可見綠色熒光，流式細胞術檢測轉染效率均達到90％以上。說明成功轉染干擾基因進入HepG2細胞，并且達到較高的轉染效率。
　?。?）有效沉默序列的篩選：TLR4 siRNA序列3轉染HepG2細胞48小時， TLR4基因和蛋白表達量最少，因此篩選TLR4 siRNA序列3為最有效沉默序列。
　?。?）雷公藤紅素對脂肪變性HepG2細胞TLR4/MyD88/NF-κB免疫炎癥信號通路的影響：與NC組相比，FFAs組HepG2細胞

13、TLR4，MyD88，NF-B和下游炎癥因子IL-1β，TNF-αmRNA和蛋白表達量都顯著增加（P＜0.05）；與FFAs組相比，TLR4 siRNA組和雷公藤紅素干預組各因子表達都顯著降低（P＜0.05）， TLR4 siRNA和雷公藤紅素聯合干預組表達進一步降低（P＜0.05），NF-κB及下游炎癥因子抑制率低于TLR4。
　　結論：
　　雷公藤多苷能夠減輕糖尿病大鼠肝臟損傷，其機制可能與下調TLR4/MyD88/NF