無(wú)血清條件下黃腐酚通過(guò)活性氧爆發(fā)途徑誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生急性死亡.pdf

1、背景：植物天然產(chǎn)物在抗腫瘤方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。近年來(lái)，啤酒花提取物黃腐酚（Xanthohumol，XN）因其廣泛的生物學(xué)活性引起了人們的普遍關(guān)注。其中，自由基生物學(xué)相關(guān)的活性機(jī)制常常會(huì)得到較早的研究。作為黃酮類(lèi)多酚化合物，XN的抗氧化活性自2000年開(kāi)始首先得到了廣泛的研究和報(bào)道；但令人困惑的是，自2007年以來(lái)，XN的促氧化活性卻也陸續(xù)在多種細(xì)胞上獲得發(fā)現(xiàn)。我組前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，XN處理人急性髓系白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞表現(xiàn)出

2、了較強(qiáng)的促氧化活性。但是，XN為什么會(huì)在細(xì)胞水平上屢屢表現(xiàn)出促氧化活性，個(gè)中原因卻仍未解決。因此，詳細(xì)解析XN在細(xì)胞水平上促氧化的具體情況，對(duì)XN促氧化活性本質(zhì)的揭示就顯得尤為重要。
　　目的：解析XN促進(jìn)HL-60細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成的規(guī)律及其對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的影響，探索ROS生成機(jī)制研究細(xì)胞模型所需的合適條件，為進(jìn)一步的ROS生成機(jī)制研究創(chuàng)造條件。
　　方法：由于普通細(xì)胞培養(yǎng)

3、過(guò)程中添加的血清對(duì)于ROS具有很強(qiáng)的清除活性，因此用于檢測(cè)ROS生成的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)選擇為無(wú)血清體系。具體方法有：應(yīng)用ROS熒光探針DCFH-DA、使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ROS產(chǎn)量，并通過(guò)對(duì)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的點(diǎn)狀圖（dot plot）數(shù)據(jù)的分析，研究細(xì)胞碎片出現(xiàn)情況；通過(guò)乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase,LDH）釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞破碎程度，并結(jié)合臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目的改變；應(yīng)用活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化以及結(jié)合PI

4、熒光染色研究細(xì)胞膜通透性的改變；應(yīng)用annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)生情況；應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IL-1β的釋放；應(yīng)用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)凋亡、焦亡、程序性壞死等程序性細(xì)胞死亡方式的標(biāo)記蛋白Caspase-3、GSDMD、MLKL的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)（1）10μM XN能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞ROS的急劇爆發(fā)，但在更高濃度的XN作用下（20和40μM）檢測(cè)到的ROS水平卻急劇下降。流式數(shù)

5、據(jù)點(diǎn)狀圖分析發(fā)現(xiàn)，20和40μM XN處理造成了HL-60細(xì)胞出現(xiàn)大量碎片，提示發(fā)生了嚴(yán)重的細(xì)胞破碎現(xiàn)象。（2）LDH釋放實(shí)驗(yàn)和臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了細(xì)胞破碎、LDH釋放到培養(yǎng)液中、細(xì)胞數(shù)目下降這些現(xiàn)象的發(fā)生。同時(shí)，用抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸（NAC）進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)NAC能夠減弱LDH的釋放量，并使細(xì)胞數(shù)目的下降情況得到緩解。提示抗氧化劑NAC對(duì)XN導(dǎo)致的HL-60細(xì)胞破碎具有保護(hù)作用，細(xì)胞破碎與ROS的產(chǎn)生相關(guān)。（3）活細(xì)胞成像

6、觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XN處理導(dǎo)致HL-60細(xì)胞迅速膨脹、PI熒光染色結(jié)果顯示質(zhì)膜通透性增加，NAC干預(yù)能有效緩解這些影響。提示細(xì)胞發(fā)生了ROS相關(guān)的膜通透性增加。（4）為了進(jìn)一步解析該急性死亡的類(lèi)型，檢測(cè)了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡和程序性壞死這三種主要類(lèi)型的細(xì)胞死亡。結(jié)果表明，這種急性細(xì)胞死亡并不屬于上述死亡方式。很可能就是因?yàn)镽OS的大量爆發(fā)導(dǎo)致的細(xì)胞急性壞死。（5）最后，探討了研究ROS生成機(jī)制所需細(xì)胞模型的建立條件。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10％血清的存在

7、可以完全掩蓋10μM和20μM XN誘導(dǎo)的ROS升高現(xiàn)象，細(xì)胞碎片也近乎消失；1%到10%不同濃度血清對(duì)10μM XN產(chǎn)生ROS影響的研究結(jié)果表明2%濃度的血清已能夠完全掩蓋ROS的生成?？梢?jiàn)，在研究ROS生成的詳細(xì)機(jī)制時(shí)，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中要排除血清的存在；而針對(duì)無(wú)血清體系造成的細(xì)胞碎片增加的弊端，需要通過(guò)劑量依賴(lài)曲線(xiàn)，綜合考慮ROS產(chǎn)量和細(xì)胞碎片這一對(duì)矛盾，選擇ROS產(chǎn)量變化的拐點(diǎn)作為最適實(shí)驗(yàn)濃度。例如，本實(shí)驗(yàn)中的10μM。
　　結(jié)論