功能性低聚糖的酶法合成及其生理功能評價.pdf

1、功能性低聚糖屬于益生元的一類,是有別于普通低聚糖的一類功能因子,其包含多種類型的物質(zhì),新型功能性低聚糖的開發(fā)是國際益生元界的熱點問題,酶工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一問題提供了契機。同時由于功能性低聚糖本身結(jié)構(gòu)的特殊性以及分離純化較為困難,在過去的研究中通常采用商品化的產(chǎn)品,或者將其僅進(jìn)行簡單分離就作為底物進(jìn)行益生功能評價,因而并不能從本質(zhì)上說明是混合物中的哪一種確定結(jié)構(gòu)的低聚糖在厭氧發(fā)酵過程中發(fā)揮了積極作用,也不能確定低聚糖結(jié)構(gòu)對于其益生功

2、能以及抑癌活性的影響。在前人的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)功能性低聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)(包括單糖殘基的類型和組成、糖苷鍵的構(gòu)型和連接方式)對于益生功能以及抑癌活性都有重大的影響作用,特別是低聚糖在腸道內(nèi)的選擇特性和發(fā)酵特性,因此從理論上闡明功能性低聚糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)與其生理功能問的關(guān)系具有重大意義。本文分為五個部分,分別重點對不同來源的β-D-半乳糖苷酶合成新型功能性低聚糖、各種單一組分低聚糖的分離純化以及結(jié)構(gòu)鑒定、酶法合成的條件優(yōu)化、不同結(jié)構(gòu)低聚糖純品體外腸

3、道益生功能比較、不同結(jié)構(gòu)低聚糖純品體外抑制人胃癌細(xì)胞株BGC-823作用進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.酶法合成功能性低聚糖及其分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定本研究選用來源于Bacillus circulans、Penicillum multicolor和Aspergillusoryzae中的β-D-半乳糖苷酶作為催化劑,分別以乳糖、乳糖和蔗糖、乳糖和N-乙酰葡萄糖胺為底物進(jìn)行酶法合成,并且使用HPLC監(jiān)測整個反應(yīng)進(jìn)程,探究不同來

4、源的酶在不同底物存在條件下產(chǎn)物的種類。通過高壓、中壓、常壓色譜結(jié)合活性炭-硅藻土吸附層析和凝膠排阻吸附層析等分離手段對酶法合成的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,得到9種低聚糖純品,將純化所得的各物質(zhì)純品通過UV、ESI-TOF-MS、1H-NMR、13C-NMR等分析手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,同時還對一種商品化的低聚果糖QHT-90S混合物進(jìn)行了HPLC分析并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。發(fā)現(xiàn)來源于B.circulans中的β-D-半乳糖苷催化的反應(yīng)生成的產(chǎn)物主要以β-(

5、1→4)糖苷鍵形式存在,另外還有少量以β-(1→3)和β-(1→6)糖苷鍵形式存在,產(chǎn)物的聚合度為2至4。酶法合成后純化得到其中的三種物質(zhì):β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-β—D-Fruf、β-D-Galp-(1→4)-β—D-Galp-(1→4)-β—D-Galp-(1→4)-D-GlcpNAc和β—D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-D-GlcpNAc前人未

6、見報道,為合成后首次命名。來源于P.multicolor和A.oryzae中的β-D-半乳糖苷催化的反應(yīng)結(jié)果相似,前者的催化效力和專一性要強于后者,產(chǎn)物主要以β-(1→6)糖苷鍵形式存在,另外還有少量以β-(1→4)糖苷鍵形式存在,產(chǎn)物的聚合度最高為3至4。
　　 2.酶法合成功能性低聚糖的條件優(yōu)化本文對反應(yīng)溫度、底物濃度、供受體比以及酶濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行研究,確定了合成各種GOS、乳果糖及其類似物、N-乙酰乳糖胺及其衍生物純品

7、的最優(yōu)條件。研究表明反應(yīng)溫度、底物濃度以及供受體比的變化對于產(chǎn)物的合成影響較大,為主要的影響條件,而酶濃度對于各產(chǎn)物最高產(chǎn)量的影響不顯著,為次要影響條件。
　　 經(jīng)過對反應(yīng)優(yōu)化,確定了各物質(zhì)合成的最佳條件如下:(1)4'-GOS3:40℃,pH6.0,60％的乳糖濃度,1.0 U/mL的酶濃度(來源于B.circulans的β-D-半乳糖苷酶)反應(yīng)6 h；(2)4'-GOS4:40℃,pH6.0,60％的乳糖濃度,1.0 U/m

8、L的酶濃度(來源于B.circulans的β—D-半乳糖苷酶)反應(yīng)8 h；(3)6'-GOS3:50℃,pH5.0,70％的乳糖濃度,0.3 U/mL的酶濃度(來源于P.multicolor的β-D-半乳糖苷酶)反應(yīng)6 h；(4)6'-GOS4:50°,pH5.0,70％的乳糖濃度,0.3 U/mL的酶濃度(來源于P.multicolor的β—D-半乳糖苷酶)反應(yīng)8 h；(5)乳果糖和4'-galactosyl-lactosucrose

9、:40℃,pH6.0,60％的總糖濃度(30％乳糖和30％蔗糖),1.0 U/mL的酶濃度(來源于B.circulans的β—D-半乳糖苷酶)反應(yīng)6 h；(6)異乳果糖:50℃,pH6.0,60％的總糖濃度(30％乳糖和30％蔗糖),1.0 U/mL的酶濃度(來源于B.circulans的β—D-半乳糖苷酶)反應(yīng)12 h；(7)N-乙酰乳糖胺、4'-galactosyl—LacNAc以及4'-digalactosyl-LacNAc:40

10、℃,pH6.0,1.0 M的總糖濃度(0.5 M乳糖和0.5 M N-乙酰葡萄糖胺),1.0U/mL的酶濃度(來源于B.circulans的β-D-半乳糖苷酶)分別反應(yīng)4、5、6 h；(8)N-乙酰異乳糖胺:60℃,pH6.0,1.0 M的總糖濃度(0.5 M乳糖和0.5 MN-乙酰葡萄糖胺),1.0 U/mL的酶濃度(來源于B.circulans的β-D-半乳糖苷酶)反應(yīng)12 h。
　　 3.不同結(jié)構(gòu)功能性低聚糖純品體外腸道益

11、生功能研究本文利用體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)的方法對酶法合成得到的不同鍵合形式、不同聚合度的系列GOS、FOS,乳果糖及其類似物純品進(jìn)行研究,利用FISH技術(shù)比較總菌群數(shù)、有益菌以及有害菌的數(shù)量,并用PI評價受試底物的益生功能；通過發(fā)酵過程中各種SCFA種類和含量的變化,確定了菌群代謝對產(chǎn)生SCFA的影響,在一定程度上闡明了其結(jié)構(gòu)與益生功能之間的關(guān)系。
　　 (Galactosyl)n-glucose(n=1-3)結(jié)構(gòu)的GOS相比較g

12、lucose-(fructosyl)n(n=1-3)結(jié)構(gòu)的FOS,PI值更高。GOS系列低聚糖對Bifidobacterium spp.具有很強的選擇性,相應(yīng)在發(fā)酵過程中有大量乙酸和乳酸生成,在GOS中,以β-(1→6)糖苷鍵相連的GOS(6'-GOS3)比β(1→4)糖苷鍵相連的COS產(chǎn)生了更高的PI；而FOS系列低聚糖卻對Lactobacillus/Enterococcus spp.具有較強的選擇性。GOS系列低聚糖的丁酸產(chǎn)生量都比

13、FOS系列低聚糖高。聚合度也會對PI造成影響,聚合度≤3的低聚糖通常12 h時PI就能達(dá)到最大值,而聚合度>3的低聚糖通常要24 h才能達(dá)到最大值,聚合度越高,益生功能越持久。除兩種普通低聚糖(乳糖和蔗糖)在24 h會引起B(yǎng)acteroides-Prevotella group和Clostridiumhistolyticum group(clustersⅠ andⅡ)數(shù)量明顯增加外,其余低聚糖與對照組相比對兩種菌屬均無增殖作用。

14、　　 以β-(1→4)糖苷鍵相連的三糖,即結(jié)構(gòu)為(galactosyl)2-glucose的4'-GOS3與結(jié)構(gòu)為galactosyl—glucosyl—fructose的乳果糖相比,會產(chǎn)生更高的PI值,而且在整個反應(yīng)時間內(nèi),Bifidobacterium spp.和Lactobacillus/Enterococcus spp.在總菌群中所占的比例均在不斷提高,若(galactosyl)2-glucose結(jié)構(gòu)中半乳糖殘基間的連接變成β

15、-(1→3)糖苷鍵形式(異乳果糖),對PI影響較大。在整個反應(yīng)時間內(nèi),異乳果糖的PI均高于4'-GOS3,同時異乳果糖在24 h時總酸量最高。以α-糖苷鍵相連的棉籽糖在24 h還會引起Clostridium histolyticum group(clustersⅠ andⅡ)數(shù)量的增加,這不利于PI的提高,而其得到的總酸量也是所有低聚糖中最少的。
　　 4.不同結(jié)構(gòu)功能性低聚糖純品體外抑制人胃癌細(xì)胞株BGC-823作用研究本文研

16、究了不同鍵合形式、不同聚合度的的GOS、FOS、乳果糖及其類似物純品對人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞的體外增殖的影響,通過比較不同作用時間以及不同作用濃度下各種功能性低聚糖純品對于胃癌細(xì)胞的抑瘤率,初步探討不同結(jié)構(gòu)功能性低聚糖純品對胃癌細(xì)胞的作用效果,在一定程度上闡明了低聚糖結(jié)構(gòu)對于癌細(xì)胞生物活性的影響。
　　 結(jié)果表明除棉籽糖外,其它低聚糖的抑瘤率與其濃度問均存在劑量依賴關(guān)系,在相同時間條件下,隨濃度的升高,抑瘤率逐漸增強；在

17、相同的濃度下,隨時間的延長,抑瘤率也相應(yīng)提高。比較低濃度(10 mg/mL)下各低聚糖的抑瘤率可知以β-(1→3)糖苷鍵相連的異乳果糖對癌細(xì)胞的抑制率要高于以β-(1→4)糖苷鍵相連的乳果糖和GOS(4'-GOS3和4'-GOS4)；以β-(1→2)糖苷鍵相連的FOS系列低聚糖也取得了較高的抑瘤率,但兩種以β-(1→6)糖苷鍵相連的GOS(6'-GOS3和6'-GOS4)在整個反應(yīng)過程中抑瘤率一直較低；同種類型低聚糖其三糖和四糖之間抑瘤