柴胡疏肝散對(duì)APP-PS1 AD小鼠的治療作用和效靶分子網(wǎng)絡(luò)探究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)又稱(chēng)老年性癡呆，是一種以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，病情呈進(jìn)行性加重。AD的主要病理特征是老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、淀粉樣血管病、顆?？张葑冃院痛竽X神經(jīng)元細(xì)胞丟失。研究發(fā)現(xiàn)，在65歲以上的患者中，AD女性患者的發(fā)病率為同齡男性的3倍。這可能與女性絕經(jīng)期后雌激素水平減少及雌激素受體(ER)通路改變相關(guān)。目前，對(duì)AD還沒(méi)有有效的治療方法。臨床發(fā)現(xiàn)

2、單一靶點(diǎn)藥物藥效局限且往往毒副作用比較大，于是逐漸轉(zhuǎn)向多藥物多靶點(diǎn)的聯(lián)合用藥，以提高療效，減輕毒副作用。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來(lái)和多學(xué)科交叉的快速發(fā)展，給中藥的研究和臨床應(yīng)用提供了新的思路。中藥復(fù)方柴胡疏肝散(CSS)出自《景岳全書(shū)》，內(nèi)含柴胡、香附、川芎、枳殼、芍藥、陳皮和甘草七味中藥。臨床廣泛用于治療胃腸疾病、婦科疾病和精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病，療效確切。其成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明。本課題擬通過(guò)柴胡疏肝散對(duì)A

3、PP/PS1阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶行為的影響，采用現(xiàn)代的技術(shù)和方法從藥理學(xué)、藥效學(xué)以及腸道微生物的角度闡述柴胡疏肝散的藥物藥效成分和作用機(jī)制。為柴胡疏肝散的藥物質(zhì)量控制、制劑加工和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:首先，選用4月齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機(jī)分為模型組(V)、柴胡疏肝散高劑量組(H，1.4g/kg)、低劑量組(L，0.7g/kg)和西藥安理申(A，2mg/kg)及同窩陰性對(duì)照組(C)。每天灌胃給

4、藥一次，連續(xù)給藥8周。采用新物體識(shí)別和水迷宮行為學(xué)檢測(cè)柴胡疏肝散對(duì)小鼠認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶的影響。免疫組化檢測(cè)APP/PS1小鼠腦內(nèi)老年斑沉積量和雌激素受體表達(dá)量。ELISA檢測(cè)小鼠腦內(nèi)海馬和皮層雌激素含量。對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠糞便16sRNA基因V3-V4區(qū)做高通量測(cè)序，檢測(cè)腸道微生物菌群變化。核磁質(zhì)譜體外檢測(cè)腦內(nèi)NAA、Cr、Cho、Tau等生化指標(biāo);檢測(cè)肝腎功能評(píng)價(jià)指標(biāo)。探討柴胡疏肝散改善APP/PS1小鼠認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力的作用與機(jī)制。然后，構(gòu)建U

5、FLC-MS/MS聯(lián)用法，檢測(cè)蒸汽提取和超聲提取兩種不同提取方法制備的柴胡疏肝散化學(xué)成分及其質(zhì)量，明確柴胡疏肝散中藥效化學(xué)成分，建立一個(gè)高效、準(zhǔn)確的質(zhì)量檢測(cè)手段。為柴胡疏肝散藥材質(zhì)量控制提供新方法。最后，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析，篩選柴胡疏肝散中符合口服利用度和類(lèi)藥性規(guī)則的藥效成分，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，查找柴胡疏肝散藥效成分作用靶點(diǎn)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)建立靶點(diǎn)與疾病AD疾病網(wǎng)絡(luò)，查找AD疾病相關(guān)靶點(diǎn)和通路。使用STRING數(shù)

6、據(jù)庫(kù)建立靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，用Cytoscape3.2.0分析軟件，建立成分-靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。闡釋柴胡疏肝散藥效成分對(duì)AD的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柴胡疏肝散和安理申能顯著改善APP/PS1模型小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。柴胡疏肝散能減少腦內(nèi)老年斑的沉積，增加小鼠腦內(nèi)雌激素含量和增加雌激素受體ERβ表達(dá)量。核磁質(zhì)譜顯示腦內(nèi)生化指標(biāo)沒(méi)有差異改變。肝腎功指標(biāo)表明柴胡疏肝散的使用劑量對(duì)APP/PS1小鼠沒(méi)有顯著影響。腸道菌群測(cè)序結(jié)果

7、發(fā)現(xiàn)，與野生組相比，模型組小鼠的腸道菌群梭菌屬（Clostridium）、厚壁菌門(mén)中的羅氏菌屬（Roseburia，屬于毛螺菌科）、Oscillospira、Prevotella、擬桿菌屬（Butyricicoccus）均顯著降低。在種（Species）水平上，與模型組相比，出現(xiàn)擬桿菌屬的一種產(chǎn)丁酸菌（pullicaecorum）在高、低劑量組、野生組和安理申組均顯著升高。分析結(jié)果表明，模型組與野生組相比，小鼠出現(xiàn)了菌群豐度和多樣性改變

8、，在藥物干預(yù)后，可以逆轉(zhuǎn)模型小鼠菌群的變化。推斷柴胡疏肝散可以改變APP/PS1小鼠腸道菌群。UFLC-MS/MS質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)果顯示，該技術(shù)對(duì)柴胡疏肝散成分和質(zhì)量檢測(cè)效率高，速度快。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水蒸氣提取法制備的柴胡疏肝散樣品芍藥苷和沒(méi)食子酸甲酯含量比超聲提取法高1.5倍，蒸汽提取法制備的樣品中，柴胡的主要成是柴胡皂甙B1和B2，而超聲提取樣品中柴胡D的含量更高。柴胡疏肝散七味中藥已報(bào)道的化學(xué)成分有670種，符合口服利用度和類(lèi)藥性篩選條件

9、的有40種，我們的質(zhì)譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)的17種化學(xué)成分中有8種滿足網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選條件。分別將上述40種和8種成分構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示柴胡疏肝散成分槲皮素的作用靶點(diǎn)最多，有384個(gè);在柴胡疏肝散40種成分中有17種作用于ERα/β靶點(diǎn)，且其對(duì)應(yīng)的AD靶點(diǎn)中網(wǎng)絡(luò)度最好的是CASP3;在柴胡疏肝散復(fù)方的8種成分對(duì)應(yīng)AD相關(guān)的25個(gè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)特征結(jié)果顯示，CASP3依然是網(wǎng)絡(luò)度最好的靶點(diǎn)，其次為MAPK1、MAPK3、CASP7、CASP8和