蝕木鏈霉菌耐熱內(nèi)切纖維素酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、纖維素是地球上最豐富的可再生的自然生物資源，而來源于低成本的可再生性纖維素資源的生物制品和生物能源對于人類的可持續(xù)發(fā)展又是非常重要的，利用纖維素酶的降解作用進(jìn)行纖維素的生物轉(zhuǎn)化有著廣闊的前景。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)將纖維素酶的基因克隆到細(xì)菌、酵母、真菌和植物中以期得到高比活力的重組型纖維素酶。
　　 放線菌可產(chǎn)生較為完整的纖維素酶體系，且很多是耐熱的。由于酶的耐熱性在生產(chǎn)中具有實用意義，所以耐熱菌成為研究的熱點

2、。本試驗克隆了蝕木鏈霉菌中的耐熱纖維素酶基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，以期得到產(chǎn)生高酶活力重組型纖維素酶的工程菌。
　　 根據(jù)從國際基因庫（GenBank）中下載的多條纖維素酶基因序列設(shè)計簡并引物，采用PCR方法擴(kuò)增纖維素酶基因，將回收的基因片段連接到用pMD-18T載體上，進(jìn)行測序分析。結(jié)果表明該全長肽基因讀碼框大小為1140bp，編碼379個氨基酸。對氨基酸序列的在線分析表明，在N端具有信號肽。
　　 根據(jù)該纖維素酶

3、基因的結(jié)構(gòu)特征和信號肽分析，構(gòu)建了全長基因和成熟肽的pET-28a重組載體，分別轉(zhuǎn)化到受體菌大腸桿菌Rosetta(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，分別得到分子量為39 kD和42 kD左右的兩條特異表達(dá)條帶。收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體用PBS洗滌后，經(jīng)反復(fù)凍融，采用DNS法對于處于不同位置的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶活力分析。發(fā)現(xiàn)含有重組質(zhì)粒pET-28a/celKX-ns的工程菌所表達(dá)出來的蛋白主要是以包涵體形式存

4、在，雖有部分可溶，但酶活性極低。而pET-28a/celKX表達(dá)的目的蛋白在破碎后的上清和培養(yǎng)基組分中的酶活都很高，分泌到培養(yǎng)基中的耐熱內(nèi)切纖維素酶占有活性的總酶量的80.3％，真正實現(xiàn)了胞外可溶性和有活性蛋白質(zhì)高效的表達(dá)，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件后，胞外酶活可達(dá)3.211IU/mL。
　　 表達(dá)產(chǎn)物酶學(xué)性質(zhì)研究表明：表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)的最適溫度分別為55℃，最適pH分別為5.5。表達(dá)產(chǎn)物具有很好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果初