線粒體內膜ATP敏感性鉀通道在慢性間歇性低壓低氧預處理對腦缺血耐受的誘導中的作用及機制研究.pdf

1、腦缺血是以腦循環(huán)血流量減少為特征的腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率的特點，已成為全球性的健康問題。而缺血性腦卒中約占腦卒中的70％-80%，不容忽視。我國衛(wèi)生部2011年發(fā)布的《中國卒中宣言》指出，腦卒中已經成為我國第一大致死疾病，發(fā)病率高居世界首位。在我國，每年用于腦卒中患者的醫(yī)藥費和護理費等開支巨大，給患者家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔，也給臨床護理人員帶來了繁重的護理負擔。因此，腦缺血的預防顯得尤為重要，腦缺血一級預防

2、的意義遠大于二級和三級預防，即在尚未出現卒中或有危險因素時即給予干預和護理，降低卒中風險，提高機體自身抵抗能力，以達到避免或減少卒中的損害嚴重程度的目的。目前亟需安全有效的一級預防措施。
　　慢性間歇性低壓低氧（CIHH）對機體具有多種有益效應，長時間以來都被用于一些疾病的預防和治療，但其可否用于預防腦卒中及其相關機制還待進一步研究。近年，線粒體作為腦缺血性損傷的亞細胞靶目標，在腦保護中的作用越來越受到重視。研究發(fā)現，腦缺血預處理

3、與線粒體內膜ATP敏感性鉀通道（mitoKATP）有關，應用mitoKATP的阻斷劑5-羥基癸酸鹽（5-HD）可以阻斷腦缺血耐受，提示mitoKATP可能也參與了腦缺血耐受的形成，但mitoKATP在CIHH誘導腦缺血耐受過程中的作用還不十分清楚。
　　目的：建立大鼠全腦缺血模型，明確CIHH可以誘導腦缺血耐受，并探討mitoKATP通道在其中的作用及其可能機制。
　　方法：健康雄性Wistar大鼠隨機分為以下7組：（1）對

4、照組（Control組）：不接受任何處理；（2）假手術組（Sham組）：永久凝閉雙側椎動脈，2 d后游離雙側頸總動脈，但不夾閉；（3）慢性間歇性低壓低氧組（CIHH組）：大鼠接受模擬5000米海拔低壓低氧環(huán)境，每天6小時，持續(xù)28天的CIHH適應處理；（4）腦缺血組（ISH組）：永久凝閉雙側椎動脈，2 d后夾閉雙側頸總動脈8 min致全腦缺血；（5）慢性間歇性低壓低氧+腦缺血組（CIHH+ISH組）：大鼠接受模擬5000米海拔低壓低氧環(huán)

5、境，每天6小時，持續(xù)28天的CIHH適應處理后，永久凝閉雙側椎動脈，2 d后夾閉雙側頸總動脈8 min致全腦缺血；（6）缺血前30分鐘給予5-HD腹腔注射（40 mg/kg），其余實驗步驟同第5組；（7）5-羥基癸酸鹽+假手術組（5-HD+Sham組）：永久凝閉雙側椎動脈，2 d后游離雙側頸總動脈前30分鐘給予5-HD腹腔注射（40 mg/kg），但不夾閉頸總動脈。
　　實驗觀察內容包括如下步驟：（1）實驗動物于造模完成后30天開

6、始采用Morris水迷宮實驗（MWM）觀測各組實驗動物學習記憶行為學功能，在行為學實驗結束后，取海馬行硫堇染色觀察CA1區(qū)錐體神經元遲發(fā)性壞死（DND）情況。（2） CIHH預處理結束后0 h，6 h，1 d，3 d，7 d和10 d等各時間點海馬CA1區(qū)mitoKATP的亞基Kir6.2，SUR1的蛋白的動態(tài)表達。（3）mitoKATP的亞基Kir6.2，SUR1于缺血后2 d和7 d時在海馬CA1區(qū)不同組間的蛋白表達比較；（4）在缺

7、血后1 d時（其他各組在相應時間點），取海馬CA1區(qū)，采用western blot技術分別觀察Cytochrome c在線粒體和胞漿中的蛋白表達情況，來比較CIHH預處理是否抑制了缺血所引起的凋亡；（5）在缺血后1 d時（其他各組在相應時間點），取海馬CA1區(qū)，采用流式細胞技術觀察各組神經元線粒體膜電位（ΔΨm）的變化，通過使用5-HD來驗證CIHH預處理誘導的腦缺血耐受是否由mitoKATP介導；（6）在缺血后3 d時（其他各組在相應

8、時間點），取海馬CA1區(qū)組織，采用透射電鏡觀察不同處理組椎體神經元及線粒體超微結構。
　　統(tǒng)計學處理數據采用均數±標準差（mean± SD）表示，應用SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數據進行統(tǒng)計學處理，各時間點兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組之間的兩兩比較采用多樣本方差分析， HG采用Kruska-Wallis法進行多樣本等級資料的秩和檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.在水迷宮的尋臺潛

9、伏期實驗中，各組大鼠隨著訓練增加，逃避潛伏期均呈現出逐漸縮短的趨勢。Sham組和CIHH組大鼠相比，逃避潛伏期無顯著性差異；在第4天時，ISH組大鼠的逃避潛伏期比Sham組明顯延長；CIHH+ISH組的逃避潛伏期跟ISH組相比又出現了縮短了；5-HD+CIHH+ISH組的逃避潛伏期比CIHH+ISH組延長，5-HD+Sham組和Sham組無顯著差異。在空間探索實驗中，Sham組和CIHH組在原平臺所在象限停留時間占總時間百分比無差異；I

10、SH組在目標象限的停留時間百分比與Sham組相比明顯減少；然而CIHH+ISH組與ISH組相比，在目標象限的停留時間百分比明顯增加；當提前應用了5-HD阻斷mitoKATP后，在目標象限的停留時間百分比又減少至接近ISH組水平；5-HD+Sham組和Sham組無顯著差異。
　　2.硫堇染色顯示，Sham組大鼠海馬CA1區(qū)神經元排列整齊、致密，約2-3層，細胞結構形態(tài)完整，邊界清晰，尼氏小體豐富，胞核大且圓、核仁清晰可見。CIHH組

11、大鼠海馬CA1區(qū)神經元未見明顯損失，與Sham組相比，無明顯變化。ISH組大鼠海馬CA1區(qū)可見神經元幾乎全部死亡，細胞結構形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體縮小，形態(tài)不規(guī)則，呈多角形或梭型，胞膜皺縮，胞核固縮，核仁模糊不清甚至消失； CIHH+ISH組大鼠海馬CA1區(qū)神經元排列整齊、致密，胞核飽滿，核仁較清晰，僅有個別胞核固縮，無明顯細胞缺失。應用5-HD后，組織學表現又接近ISH組。5-HD+Sham組和Sham組無顯著差異。
　　3.與C

12、on組相比，CIHH處理28天后0h，6 h，1 d，3 d，7 d mitoKATP的兩個亞基Kir6.2和SUR1的蛋白表達均顯著增高，CIHH后10d無明顯差異。
　　4.CIHH處理28天后2天或7天，與Sham組相比，CIHH組mitoKATP的兩個亞基Kir6.2和SUR1的蛋白表達顯著增高，與ISH組相比，CIHH+ISH組線粒體亞基Kir6.2和SUR1的蛋白表達顯著增高。
　　5.與Sham組相比，CIHH

13、組大鼠海馬組織胞漿內 Cytochrome c明顯減少，與ISH組大鼠相比，CIHH+ISH組大鼠胞漿內Cytochrome c明顯減少，與CIHH+ISH組大鼠相比，5-HD+CIHH+ISH組大鼠胞漿內 Cytochrome c明顯增多，而線粒體內的Cytochrome c的變化與胞漿內相反。
　　6.與Sham組相比，ISH組ΔΨm的水平顯著降低，與ISH組相比， CIHH+ISH組能明顯抑制ΔΨm的水平的降低，保持ΔΨm水

14、平的穩(wěn)定，與CIHH+ISH組相比，5-HD+CIHH+ISH組ΔΨm水平明顯降低，說明5-HD取消了CIHH對ΔΨm水平降低的抑制作用。
　　7.與Sham組相比，CIHH組無明顯變化，ISH組中線粒體的超微結構發(fā)生明顯改變，表現為廣泛的空泡化、嚴重的嵴斷裂以及伴有膜破壞；而CIHH+ISH組可部分改善線粒體的結構變化，5-HD+CIHH+ISH組與CIHH+ISH相比，其線粒體又出現了明顯損傷，其表現與ISH組的線粒體超微結構

15、相似。
　　結論：
　　1.CIHH預處理可以誘導腦缺血耐受，減輕缺血造成的神經元遲發(fā)性壞死、線粒體超微結構損傷以及學習記憶的損傷。
　　2.CIHH預處理上調了海馬CA1區(qū)神經細胞的mitoKATP的兩個亞基Kir6.2和SUR1的表達，并且對抗了腦缺血所致的兩個亞基表達的降低。
　　3.CIHH可以對抗腦缺血時線粒體膜電位的下降和線粒體凋亡的啟動蛋白Cytochrome c的外流。
　　4.通過使用5-