局部亞低溫激活線粒體ATP敏感性鉀通道對大鼠全腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：觀察局部亞低溫對大鼠全腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，探討局部亞低溫激活線粒體ATP敏感性鉀通道及其腦保護(hù)的可能機(jī)制。 方法： 1、實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制備雄性健康SD大鼠32只，月齡2～3月，體重200～250g(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為4組(n=8)：假手術(shù)組(S組)：暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈和基底動(dòng)脈，基底動(dòng)脈僅穿線不阻斷，維持正常體溫(36.5～37.5℃)，觀察12小時(shí)；缺血/再灌注組(I/R組)：暴

2、露雙側(cè)頸總動(dòng)脈和基底動(dòng)脈，雙側(cè)頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾夾閉，基底動(dòng)脈穿線并阻斷，缺血10 min，再灌12小時(shí)，維持正常體溫(36.5～37.5℃)；亞低溫組(H組)：暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈和基底動(dòng)脈，雙側(cè)頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾夾閉，基底動(dòng)脈穿線并阻斷，缺血10min，再灌12小時(shí)，再灌注前即刻經(jīng)股靜脈輸注3.5 ml 10℃生理鹽水，結(jié)合冰袋冷敷頭部，采用60 W白熾燈泡距離大鼠37 cm高度直接照射身體，通過調(diào)節(jié)燈至身體的距離及頭部冰塊的數(shù)量來調(diào)節(jié)，使鼓膜

3、溫度在1 min內(nèi)降至32～34℃，肛溫在20 min內(nèi)恢復(fù)并維持于正常體溫(36.5～37.5℃)，頭部低溫維持3小時(shí)，自然復(fù)溫；5-羥基葵酸鈉組(5-HD組)：缺血前30 min，腹腔注射1 mg/ml的5-羥基葵酸鈉10 mg/kg，余處理同H組。其它三組于缺血前30 min，腹腔內(nèi)注射等容積生理鹽水。全腦缺血/再灌注模型制備：采用三血管阻斷法。 2、檢測指標(biāo)及檢測方法2．1.1各組動(dòng)物體重，月齡。 2．1.2

4、各組動(dòng)物腦缺血前5 min(T1)、腦缺血10 min(T2)、再灌注后10 min(T3)分別采集股動(dòng)脈血監(jiān)測血?dú)庵笜?biāo)。 2．2神經(jīng)行為學(xué)評分再灌注12小時(shí)分別進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評估。格子爬行實(shí)驗(yàn)(OFT)：將動(dòng)物置于分析箱的正中方格中，觀察5 min內(nèi)動(dòng)物的跨格次數(shù)(三爪以上跨入鄰格)，分析箱大小為1 m×1 m×0.4 m，箱底分為25個(gè)方格(20 cm×20 cm)。斜板實(shí)驗(yàn)(IPT)：將大鼠按頭向下的方向置于45度傾斜的

5、木板上，記錄大鼠本能的轉(zhuǎn)體為頭向上所需的時(shí)間。 2．3腦組織勻漿超氧化歧化酶(SOD)活性缺血/再灌注12小時(shí)，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，斷頭處死大鼠。在冰盤上迅速取出右側(cè)大腦半球，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用黃嘌呤氧化酶法測定腦組織勻漿SOD活性。 2．4腦組織勻漿丙二醛(MDA)濃度缺血/再灌注12小時(shí)，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，斷頭處死大鼠。在冰皿上迅速取出右側(cè)大腦半球，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用硫代巴比?/p>

6、酸法測定腦組織勻漿MDA濃度。 2．5腦水含量缺血/再灌注12小時(shí)，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，斷頭處死大鼠后，在冰盤上迅速取出腦組織取左側(cè)大腦半球，濾紙吸干表面水份，置于干燥小瓶中-20℃保存。用干(110℃，24小時(shí)烘干)、濕重法計(jì)算腦水含量，作為腦水腫程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)。 2．6血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的濃度缺血/再灌注12小時(shí)，水合氯醛腹腔注射，麻醉后取頸內(nèi)靜脈血1 ml，37.5℃恒溫水箱中水浴30 mi

7、n后，以半徑8 cm、以轉(zhuǎn)速3500 r/min離心10 min，取血清，置于液氮罐中保存?zhèn)溆?。采用Elisia法測定血清NSE的濃度。 2．7光鏡下觀察腦神經(jīng)元病理學(xué)改變水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，斷頭處死大鼠后，取右側(cè)大腦半球額葉皮質(zhì)組織，冰盤上切取厚度為3 mm組織塊，面積5 mm×5 mm，冷鹽水沖洗干凈后，置于4％多聚甲醛中搖勻，室溫下過夜，在10×40光鏡下觀察皮質(zhì)神經(jīng)元的病理學(xué)改變。 2．8電子顯微鏡觀察

8、腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化斷頭處死大鼠后，在冰盤上迅速取出腦組織，取右側(cè)大腦半球額葉皮質(zhì)組織，按照“快、小、輕、準(zhǔn)”四字原則取材，將大小約1 mm×1 mm×1mm腦組織致于4％戊二醛中固定，4℃冰箱中保存，固定1小時(shí)以上，送電鏡實(shí)驗(yàn)室，在透射電鏡下觀察皮質(zhì)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1．1 各組動(dòng)物體重、月齡，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 1.2在腦缺血前5 min(T1)、腦缺血10 min(T2)、再

9、灌注后10 min(T3)血?dú)庵笜?biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 2 神經(jīng)行為學(xué)評分OFT試驗(yàn)：與S組比較，I/R組、5-HD組大鼠爬格子數(shù)減少(P<0.05)；與S組比較，H組爬格子數(shù)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與I/R組比較，S組、H組爬格子數(shù)增多(P<0.05)：與5-HD組比較，S組、H組爬格子數(shù)增多(P<0.05)；與5-HD組比較，I/R組爬格子數(shù)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 IPT

10、試驗(yàn)：與S組比較，I/R組、5-HD組頭轉(zhuǎn)向時(shí)間增加(P<0.05)；與S組比較，H組頭轉(zhuǎn)向時(shí)間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與I/R組比較，S組、H組大鼠頭轉(zhuǎn)向時(shí)間減少(P<0.05)；與5-HD組比較，S組、H組頭轉(zhuǎn)向時(shí)間增加p<0.05)，I/R組頭轉(zhuǎn)向時(shí)間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3 腦組織勻漿超氧化歧化酶(SOD)活性變化I/R組、H組、5-HD組與S組相比較，腦組織勻漿SOD活性降低(P<0.05)

11、；與S組比較，I/R組腦組織勻漿SOD活性降低(P<0.05)，與I/R組比較，H組腦組織勻漿SOD活性升高(P<0.05)，與I/R組比較，5-HD組腦組織勻漿SOD活性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與S組和H組比較，5-HD組腦組織勻漿SOD活性下降(P<0.05)。 4 腦組織勻漿丙二醛(MDA)濃度變化I/R組、H組、5-HD組與S組相比較，腦組織勻漿MDA活性升高(P<0.05)；與S組比較，I/R組腦組織勻漿M

12、DA活性升高(P<0.05)，與I/R組比較，H組腦組織勻漿MDA括性降低(P<0.05)，與I/R組比較，5-HD組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與S組和H組比較，5-HD組腦組織勻漿MDA濃度升高(P<0.05)。 5 腦水含量的測定與S組相比較，I/R組、5-HD組腦含水量增加(P<0.05)；與S組比較，H組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與I/R組比較，H組腦含水量降低(P<0.05)；與5-HD組比較，H組腦

13、含水量降低(P<0.05)，I/R組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 6 血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的濃度值與S組相比較，I/R組、5-HD組大鼠血清NSE的濃度升高(P<0.05)；與S組比較，H組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)：與I/R組比較，H組大鼠血清NSE的濃度降低(P<0.05)；與5-HD組比較，H組血清NSE的濃度降低(P<0.05)，I/R組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 7 光鏡下

14、觀察神經(jīng)元病理學(xué)改變S組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，胞漿豐富、均勻淡染，核圓形或橢圓形，核仁清楚。I/R組大部分神經(jīng)細(xì)胞固縮，損傷范圍擴(kuò)大，嗜伊紅性，尼氏體分解或消失，核漿分界不清，核仁不清。H組部分神經(jīng)細(xì)胞輕度固縮，結(jié)構(gòu)基本正常，核橢圓形，核仁清楚。5-HD組部分神經(jīng)細(xì)胞固縮，損傷范圍擴(kuò)大，嗜伊紅性，尼氏體分解或消失，核漿分界不清，核仁不清。H組較I/R組和5-HD組損傷輕，I/R組和5-HD組較S組損傷重。 8 電子顯微鏡觀

15、察腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化S組神經(jīng)元形結(jié)構(gòu)基本正常的，細(xì)胞核和細(xì)胞膜稍水腫，細(xì)胞器完整，數(shù)量無減少；線粒體極少部分嵴和膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度脫顆?，F(xiàn)象，高爾基復(fù)合體基本正常，可見次級溶酶體。I/R組神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)高度水腫，細(xì)胞器數(shù)量顯著減少，核質(zhì)也中度水腫；細(xì)胞質(zhì)高度水腫，線粒體部分或大部分嵴和膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆?，F(xiàn)象嚴(yán)重，部分雙層核膜和細(xì)胞膜融合或消失，次級溶酶體核膜融合(不典型高爾基復(fù)合體)。H組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常的，細(xì)胞

16、質(zhì)有極輕度水腫，局部輕度水腫：線粒體部分嵴融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度脫顆?，F(xiàn)象，高爾基復(fù)合體扁平囊輕度擴(kuò)張，可見次級溶酶體。5-HD組細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)明顯水腫；細(xì)胞質(zhì)明顯水腫，細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體大部分或全部嵴、部分或大部分膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒現(xiàn)象嚴(yán)重，細(xì)胞質(zhì)高度水腫，次級溶酶體數(shù)量顯著減少。H組神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)較I/R組和5-HD組損傷減輕，但與S組比較神經(jīng)元損傷加重，5-HD組與I/R組比較損傷程度基本相同。 結(jié)論