ATP敏感性鉀通道開放劑對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及信號轉導機制.pdf

1、缺血性腦血管病是目前嚴重危害人類健康的疾病，臨床上一直把尋找確實有效的腦保護藥物作為研究的重點內(nèi)容。ATP敏感性鉀通道(KATP)開放劑是近年新興的一種腦保護劑，但其保護作用機制仍不清楚。腦缺血治療的關鍵是減輕腦缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元凋亡。細胞內(nèi)有一套精細復雜的信號系統(tǒng)在調控著凋亡過程。目前認為死亡受體通路和線粒體通路是細胞凋亡的主要信號轉導通路，而死亡受體通路和線粒體通路分別以caspase-8和caspase-9的激活為特征，二者再進

2、一步激活下游的caspase-3，最終誘導細胞凋亡。我們的實驗觀察了KATP通道開放劑對大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損評分、神經(jīng)元凋亡及caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA和蛋白表達的影響，探討KATP通道開放劑對腦缺血再灌注損傷的保護作用及信號轉導機制，為臨床應用KATP通道開放劑治療缺血性腦血管病提供了科學的實驗依據(jù)，具有深遠的實際應用意義。 實驗方法：選擇Wistar雄性大鼠220

3、只隨機分為四組：A組(假手術組)、B組(缺血組)、C組(KATP通道開放劑治療組)及D組(KATP通道開放劑+阻斷劑治療組)。應用改良Nagasawa線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，應用TTC染色觀察梗死體積，記錄神經(jīng)功能缺損評分；應用TUNEL法觀察神經(jīng)元凋亡；應用免疫組化、原位雜交、RT-PCR技術研究腦缺血再灌注后caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA及其蛋白的表達，探討KATP通道

4、開放劑對腦缺血再灌注損傷的保護作用及信號轉導機制。所有實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差(-x±s)表示。所得數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析。 實驗結果：1.腦梗死體積A組未發(fā)現(xiàn)有梗死病灶，B、C、D組梗死病灶主要位于右側額頂葉皮質及尾狀核、殼核區(qū)域。B、C、D組梗死體積與A組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。C組梗死體積明顯小于B組和D組(P＜0.01)，D組與B組相比無顯著性差異(P＞0.05)。

5、 2.神經(jīng)功能缺損評分B、C、D組神經(jīng)功能缺損評分與A組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。C組神經(jīng)功能缺損較B、D組明顯減輕(P＜0.05)，B、D組之間無顯著性差異(P＞0.05)。 3.神經(jīng)元凋亡結果A組僅見少量凋亡細胞，B、C、D組凋亡細胞主要分布于缺血周邊區(qū)，即缺血半暗帶內(nèi)。凋亡細胞于腦缺血再灌注后6h增多，隨時間延長逐漸增多，于腦缺血再灌注后24h凋亡細胞數(shù)達到高峰，缺血后48h、72h凋亡細胞數(shù)逐漸減少。各組在缺

6、血中心區(qū)凋亡細胞表達均較少。B、C、D組各時間點凋亡細胞與A組相比均有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)，C組6h時間點凋亡細胞與B、D組相比有下降，但統(tǒng)計學元顯著性差異(P＞0.05)，C組其余各時間點凋亡細胞數(shù)較B、D組均顯著減少(P＜0.01，P＜0.05)。D組各時間點凋亡細胞數(shù)與B組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。 4.免疫組化結果A組僅見少量陽性細胞表達，B、C、D組各時間點caspase-3、caspas

7、e-8、caspase-9陽性細胞主要分布于缺血周邊區(qū)，即半暗帶內(nèi)，缺血中心區(qū)內(nèi)較少表達。B、C、D組caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達均于腦缺血再灌注后6h開始增加，以后隨缺血時間延長，陽性細胞逐漸增多，24h達高峰，以后表達下降。C組僅caspase-8蛋白在6h時間點與B、D組無顯著性差異(P＞0.05)，其余各時間點C組的caspase-3、caspase-8、及caspase-9蛋白表達均顯著少

8、于B組和D組(P＜0.01，P＜0.05)，D組各時間點caspase-3、caspase-8、及caspase-9蛋白表達與B組比較無顯著性差異(P＞0.05)。 5.原位雜交結果A組僅見少量陽性細胞表達，B、C、D組caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA的陽性細胞主要分布于缺血周邊區(qū)內(nèi)，缺血中心區(qū)內(nèi)較少表達。缺血再灌注后6h陽性細胞表達開始增加，24h達高峰，以后表達下降。C組僅caspase-9

9、mRNA陽性細胞在6h時間點與B，D組相比無顯著性差異(P＞0.05)，其余各時間點caspase-3，caspase-8，caspase-9mRNA陽性細胞表達均顯著少于B組和D組(P＜0.01，P＜0.05)，D組各時間點陽性細胞表達與B組比較無顯著性差異(P＞0.05)。 6.RT-PCR結果A組caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA僅見微弱表達，B、C、D組caspase-3、caspase-

10、8和caspase-9mRNA隨腦缺血再灌注時間延長，表達逐漸增強，于缺血再灌注后24h達高峰，以后表達逐漸減弱。C組各時間點caspase-3、caspase-8和caspase-9mRNA的表達均顯著少于B組和D組(P＜0.01)，D組各時間點caspase-3、caspase-8和caspase-9mRNA的表達與B組比較無顯著性差異(P＞0.05)。 結論：1.KATP通道開放劑能顯著減少腦缺血再灌注后梗死體積，改善神經(jīng)