人胚胎干細(xì)胞系向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化差異的研究.pdf

1、人類胚胎干細(xì)胞(humanembryonicstemcells,hESCs)的研究為細(xì)胞替代治療開辟了新的途徑,可是越來越多的證據(jù)表明不同hESCs系間在分化潛能等方面存在諸多差異,這使得hESCs在臨床轉(zhuǎn)化和疾病模型的研究上變得異常困難。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(theretinalpigmentepithelium,RPE)由視杯外側(cè)細(xì)胞發(fā)育而來,位于脈胳膜和神經(jīng)視網(wǎng)膜之間,由單層緊密相連的色素上皮細(xì)胞組成,對(duì)于維持光受體的正常功能起著重

2、要作用。RPE的營養(yǎng)不良、病變和缺失會(huì)造成老年性黃斑變性(Age-relatedmaculardegeneration,AMD)和少年型黃斑營養(yǎng)不良(Stargardt'smaculardystrophy,SMD)等疾病。人們先后嘗試了多種hESCs向RPE自發(fā)分化與誘導(dǎo)分化的方法,并通過實(shí)驗(yàn)證明了誘導(dǎo)分化來的RPE與內(nèi)源性RPE在表達(dá)譜和吞噬等方面十分相似,但是現(xiàn)有方法分化效率較低,分化周期較長,遠(yuǎn)不足以滿足臨床移植的需求。近年來,許

3、多研究報(bào)道了miRNA在誘導(dǎo)體細(xì)胞向iPS重編程中以及hESCs在向特定類型細(xì)胞分化中起著重要的作用。對(duì)hESCs系間的差異性、hESCs向RPE誘導(dǎo)分化以及miRNA在hESCs向RPE分化過程中作用的研究,將為干細(xì)胞療法的臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究以H9和HSF1兩個(gè)不同的hESCs系作為研究對(duì)象,比較了兩個(gè)系之間向RPE誘導(dǎo)分化效率上的差異,并試圖通過長期培養(yǎng)觀察和對(duì)傳代早期與晚期細(xì)胞中RPE65和CRALBP兩個(gè)成

4、熟標(biāo)記的表達(dá)情況的分析尋找更多的差異。此外,我們還嘗試使用RPE中特異性高表達(dá)的miRNAs對(duì)hESCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化,試圖尋找到高效快速的誘導(dǎo)分化方法。研究結(jié)果小結(jié)如下:
　　 1、通過比較H9和HSF1向RPE誘導(dǎo)分化的效率,發(fā)現(xiàn)無論是使用Dkk-1和Lefty-A誘導(dǎo)分化方法,還是使用NIC誘導(dǎo)分化方法,H9和HSF1兩個(gè)細(xì)胞系在色素團(tuán)產(chǎn)生的效率上都存在顯著差異,其中,HSF1比H9產(chǎn)生色素團(tuán)的效率更高。
　　 2、

5、經(jīng)過7個(gè)月的連續(xù)傳代培養(yǎng),我們觀察到H9可以很好地保持色素成分,而HSF1中色素逐漸變淡。對(duì)RPE成熟標(biāo)記RPE65和CRALBP的Q-PCR檢測分析發(fā)現(xiàn),在兩種不同的誘導(dǎo)分化方法中,CRAlBP表達(dá)量都存在顯著性差異,而RPE65的表達(dá)量則沒有顯著性差異。在培養(yǎng)至第9個(gè)月時(shí),對(duì)CRALBP和RPE65的Q-PCR的檢測結(jié)果顯示,在兩種不同的誘導(dǎo)分化方法中,RPE65在H9中的表達(dá)量相比在HSF1中都存在顯著性差異。用NIC誘導(dǎo)分化的兩

6、個(gè)系中,CRALBP表達(dá)量上的差異消失,而用Dkk-1/Lefty-A誘導(dǎo)分化的兩個(gè)系中,依然存在顯著性差異。這提示我們?cè)谔岣哒T導(dǎo)分化效率的同時(shí),還應(yīng)考慮到不同誘導(dǎo)分化方法對(duì)細(xì)胞表達(dá)譜的影響,從而進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)分化方法,以滿足臨床需求。
　　 3、對(duì)現(xiàn)有誘導(dǎo)分化方法進(jìn)行了優(yōu)化,一是在誘導(dǎo)分化前1個(gè)小時(shí)加入Y-27632處理細(xì)胞,防止在細(xì)胞團(tuán)只有少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)死亡的可能;二是在誘導(dǎo)分化前,把用于誘導(dǎo)分化的細(xì)胞鋪在O.1％明膠包

7、被的培養(yǎng)皿中以去除飼養(yǎng)層細(xì)胞;三是在用Dkk-1和Lefty-A誘導(dǎo)分化時(shí),在第3天換液時(shí)直接換成只含10%KSR的培養(yǎng)基,利用低血清條件誘導(dǎo)細(xì)胞快速走向分化。結(jié)果表明,在matrigel上自發(fā)分化出色素團(tuán)的時(shí)間為30天,比目前報(bào)道的6～8周有所提前。用Dkk-1和Lefty-A誘導(dǎo)分化出色素團(tuán)的時(shí)間為27天,比目前報(bào)道的90天有明顯提前。但用NIC誘導(dǎo)分化的方法也需要27天,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
　　 4、對(duì)RPE的逆分化生長特性

8、進(jìn)行了研究。使用Dis/Col消化5分鐘后,用玻璃針分離成100-200個(gè)細(xì)胞的團(tuán),在同一孔中接種較多的細(xì)胞團(tuán),可以一定程度上抑制逆分化的發(fā)生。RPE細(xì)胞不易貼壁,在用FBS替換KSR后,較易貼壁。為了改善貼壁效果,可用多聚鳥氨酸和層粘連蛋白包被培養(yǎng)板。
　　 5、嘗試使用慢病毒在hESCs中過表達(dá)RPE特異性高表達(dá)的miR-204和miR-211,以期快速誘導(dǎo)其向RPE分化。此外,還嘗試用此方法誘導(dǎo)逆分化的RPE向成熟RPE分