小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和小鼠胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、研究背景：
　　 視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal Pigment EPithelium， RPE)具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和特殊的生理機(jī)能[1]。RPE能吞噬脫落的光感受器細(xì)胞外節(jié)膜盤(rodoutersegmeni， ROS)，這對光感受器細(xì)胞外節(jié)的更新及維持正常視覺功能至關(guān)重要，其功能障礙會導(dǎo)致嚴(yán)重視網(wǎng)膜疾病和一些嚴(yán)重的遺傳性變性眼病，如Best病、Stargardt病、Leber先天性黑曚和年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related

2、 macular degeneration， AMD)等[2]。因此應(yīng)用RPE細(xì)胞移植治療某些眼底疾病是其中的一個(gè)研究熱點(diǎn)，目前面臨的主要問題是如何獲得合適的RPE移植細(xì)胞，才能在移植后與宿主殘留的視網(wǎng)膜細(xì)胞達(dá)到最佳的整合效果，以求最大限度地重建患者的視功能。
　　 組織細(xì)胞工程尤其是干細(xì)胞工程的興起為視網(wǎng)膜損傷的治療提供了一種新的途徑。極小胚胎樣干細(xì)胞(very small embryonic-like stem cell，

3、VSEL)是美國路易斯維爾大學(xué)Kucia研究小組從小鼠骨髓和人臍帶血中分離出scal＋lin-CD45-、具有類似胚胎干細(xì)胞生物特性的的多能干細(xì)胞[3]，Liu[4]等從小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮中分離了相似的視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞(retinal multipotential stem-like cells， retinal PSC)。已有研究證實(shí)：這些多潛能干細(xì)胞不僅具有與胚胎干細(xì)胞相似的形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞標(biāo)記物，而且具有胚胎干細(xì)胞多分化潛能的特

4、性，在體外可以被誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層、中胚層、外胚層細(xì)胞，潛在分化能力強(qiáng)，若作為組織工程和臨床治療的種子細(xì)胞，可避免倫理爭議，具有良好的應(yīng)用前景。通過免疫磁珠分選的方法，我們從新生小鼠小鼠的神經(jīng)視網(wǎng)膜組織中得到scal＋lin-CD45-的同一細(xì)胞亞群，通過細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞儀檢測其特性，為視網(wǎng)膜移植的供體選擇提供新的來源。
　　 當(dāng)然，目前最廣泛的種子細(xì)胞來源還是胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell， ES)。<

5、br>　　 胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ES)具有無限擴(kuò)增和多向分化潛能的特點(diǎn)，因此關(guān)于其誘導(dǎo)分化的研究成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。如能在體外將胚胎干細(xì)胞(ESCs)源源不斷地誘導(dǎo)分化成患者所需要的靶細(xì)胞（如RPE、光感受器細(xì)胞細(xì)胞），可望突破視網(wǎng)膜移植中面臨的供體來源有限的難題，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，將ESCs體外誘導(dǎo)分化成RPE細(xì)胞的研究已經(jīng)取得了一定的成果，借鑒皮膚黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)采用的ST2細(xì)胞層和類似的

6、誘導(dǎo)條件，采用PA6間充質(zhì)細(xì)胞系作為飼養(yǎng)細(xì)胞層，小鼠ES細(xì)胞能分化為呈六角形排列的、胞漿中出現(xiàn)色素顆粒的RPE細(xì)胞，但其誘導(dǎo)效率低[5]。除了共培養(yǎng)[4]或組織移植，目前尚無較好獲得有效RPE的高效率方法。因此，我們設(shè)想建立一種無飼細(xì)胞層體外培養(yǎng)的小鼠ES誘導(dǎo)成光感受器和RPE的培養(yǎng)體系，提高ES向RPE誘導(dǎo)效率。
　　 目的：
　　 1探討免疫磁珠分選方法從新生C57小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮中分離出具有多潛能干細(xì)胞特性的sc

7、al＋lin-CD45-細(xì)胞群的可行性。
　　 2研究小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞的形態(tài)特征及基因表達(dá)差異。
　　 3探討小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞向RPE分化的途徑，建立一種無飼細(xì)胞層培養(yǎng)的小鼠ES分步誘導(dǎo)成RPE的高效培養(yǎng)體系。
　　 方法：
　　 1小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞的獲?。喝〕跎?天C57小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜組織制成單細(xì)胞懸液，使用免疫磁珠分選的方法先行Lin-陰性分選后行Scal＋陽性分選得

8、到scal＋lin-CD45-細(xì)胞群，使用流式細(xì)胞技術(shù)和細(xì)胞免疫熒光法鑒定其具有極小胚胎樣干細(xì)胞的特性。
　　 2小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)：用小鼠成纖維細(xì)胞作為飼細(xì)胞層，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基和胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)兩種細(xì)胞，并觀察形態(tài)特性。
　　 3小鼠胚胎干細(xì)胞和視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞及RPE的鑒定：采用堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase， AKP)進(jìn)行小鼠ES鑒定，采用免疫組織化學(xué)

9、方法檢測小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞；用Real Time-PCR方法檢測全能性基因Oct4， Nagnog， Sox2在小鼠ES，小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞與小鼠RPE的表達(dá)差異；Reverse Transcription-PCR檢測小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor， MITF)、酪氨酸酶(Tyrosinase，Tyr)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrosinase r

10、elated protein-1， TRP1)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞65蛋白(retinal pigmentepithelial protein-65， RPE65)在小鼠ES，視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞與RPE的表達(dá)差異。
　　 4小鼠ES與誘導(dǎo)產(chǎn)生的RPE基因表達(dá)差異性檢測：小鼠ES無飼細(xì)胞層培養(yǎng)，并添加誘導(dǎo)因子進(jìn)行26天的誘導(dǎo)方案，采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法檢測誘導(dǎo)形成的RPE， Real Time-PCR檢測ES和RPE的Oct4、

11、Nagnog、Sox2基因表達(dá)差異，Reverse Transcription-PCR檢測MITF、TYR、TYRP1、RPE65在小鼠ES與RPE的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果v
　　 1小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞分選率：利用免疫磁珠分選的方法從新生小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜組織中分離出scal＋lin-CD45-細(xì)胞群，細(xì)胞計(jì)數(shù)分選得率為1.2％。該細(xì)胞群干細(xì)胞抗原Scal表達(dá)率達(dá)96.5％，大小為2-6um，形態(tài)呈小圓形，核質(zhì)比高。

12、r>　　 2小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)、免疫組化及基因表達(dá)：形態(tài)呈小圓形，直徑2到6um，Scal表達(dá)陽性；全能性基因Oct4、Nagnog、Sox2的表達(dá)比小鼠ES低，比小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞高，不表達(dá)RPE的標(biāo)記性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65；小鼠ES呈克隆狀生長，排列緊密，細(xì)胞集落隆突有立體感，邊緣整齊清晰，形似鳥巢。單個(gè)細(xì)胞胞漿少，細(xì)胞核大，核仁明顯，界限不清。AKP陽性，全能性基因Oct4、Nagnog

13、、Sox2的高表達(dá)。
　　 3小鼠ES向RPE的定向誘導(dǎo)：本實(shí)驗(yàn)中尚未從小鼠視網(wǎng)膜多潛能干細(xì)胞成功獲得RPE；但小鼠ES無飼細(xì)胞層培養(yǎng)并添加誘導(dǎo)因子可定向分化為RPE，獲得的RPE角蛋白表達(dá)陽性，Oct4、Nagnog、Sox2不表達(dá)，表達(dá)RPE的標(biāo)記性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65。
　　 結(jié)論：
　　 1利用免疫磁珠分選的方法可以從新生C57小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中成功分離出scal＋lin-CD45-