HSV-1感染對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞的影響.pdf

1、第一部分HSV-1感染對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 目的：建立單純皰疹病毒1型(Herpessimplexvirustype1，HSV-1)感染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(Retinalpigmentepithelialcell，RPE)的體外模型，觀察HSV-1感染對(duì)體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 方法：以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)為5的HSV-1(F株)感染體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞。

2、用相差顯微鏡觀察RPE細(xì)胞的形態(tài)變化；用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)觀察HSV-1感染對(duì)RPE細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響；用PCR和免疫熒光法驗(yàn)證HSV-1感染RPE細(xì)胞是否成功。 結(jié)果：成功在體外建立了HSV-1感染RPE的細(xì)胞模型。HSV-1感染RPE細(xì)胞8h后出現(xiàn)病變，細(xì)胞形態(tài)開始變得細(xì)長(zhǎng)和皺縮；感染24h后細(xì)胞病變更加明顯，細(xì)胞間間隙增加，甚至可見多核巨細(xì)胞；感染48h后所有細(xì)胞均變圓，細(xì)胞開始出現(xiàn)脫落甚至死亡。MTT結(jié)果顯

3、示HSV-1感染RPE24h和48h后能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.01)，細(xì)胞的抑制率分別為(16.37±3.28)％和(47.91±6.39)％；流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HSV-1感染可影響RPE細(xì)胞的細(xì)胞周期，但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。 結(jié)論：HSV-1能感染體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞，抑制RPE細(xì)胞的增殖，并影響RPE細(xì)胞的細(xì)胞周期。 第二部分HSV-1感染對(duì)人角膜上皮細(xì)胞及其TGF—βs和SMADs表達(dá)的影響 目的：建立單

4、純皰疹病毒1型(Herpessimplexvirustype1，HSV-1)感染人角膜上皮細(xì)胞(humancornealepithelialcell，HCE)的體外模型，觀察HSV-1感染對(duì)HCE細(xì)胞中TGF—βs(TGF—β1、TGF—β2和TGF—β3)和SMADs(SMAD2和SMAD3)表達(dá)的影響。 方法：以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)為5的HSV-1(F株)感染體外培養(yǎng)的HCE細(xì)胞

5、。在HSV-1感染HCE細(xì)胞0、4、8、12和24小時(shí)后，用相差顯微鏡觀察HCE細(xì)胞的形態(tài)變化；用RT—PCR(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)檢測(cè)HCE細(xì)胞中TGF—βs(TGF—β1、TGF—β2和TGF—β3)和SMADs(SMAD2和SMAD3)基因的表達(dá)；用間接免疫熒光法觀察HCE細(xì)胞中TGF—β1、TGF—β2，SMAD3和磷酸化SMAD3蛋白的表達(dá)；同時(shí)還用ELISA

6、的方法檢測(cè)了HSV-1感染HCE細(xì)胞后TGF—β1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：HSV-1感染HCE細(xì)胞后，同正常HCE細(xì)胞形態(tài)相比較，感染后8hHCE細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變，細(xì)胞間間隙增加，可見較多多核巨細(xì)胞，感染24h后細(xì)胞病變更加明顯，細(xì)胞開始出現(xiàn)脫落甚至死亡；RT—PCR結(jié)果顯示TGF—β1在HSV-1感染HCE8h后表達(dá)開始降低，12h和24h降低更為明顯(p<0.01)，SMAD3在HSV-1感染HCE12h和24h后表達(dá)顯著降低，

7、而TGF—β2、TGF—β3和SMAD2基因表達(dá)無(wú)明顯變化；間接免疫熒光結(jié)果顯示TGF—β1、SMAD3和磷酸化SMAD3蛋白在HSV-1感染HCE12h和24h后表達(dá)較正常HCE細(xì)胞降低，而TGF—β2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；同時(shí)ELISA結(jié)果亦顯示HSV-1感染HCE12h和24h后TGF—β1蛋白表達(dá)降低。 結(jié)論：HSV-1能感染體外培養(yǎng)的HCE細(xì)胞，TGF—β1和SMAD3可能參與了HSV-1感染角膜上皮細(xì)胞的病理過(guò)程。

8、 第三部分HSV-1感染人角膜上皮細(xì)胞后病毒miRNA的表達(dá)變化 目的：建立單純皰疹病毒1型(Herpessimplexvirustype1，HSV-1)感染人角膜上皮細(xì)胞(humancornealepithelialcell，HCE)的體外模型，觀察不同濃度的HSV-1感染HCE細(xì)胞后病毒miRNA的表達(dá)變化。 方法：以感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)分別為5，1和0.1的HSV-

9、1(F株)感染體外培養(yǎng)的HCE細(xì)胞，在HSV-1感染HCE細(xì)胞24小時(shí)后，用RealtimePCR方法檢測(cè)HCE細(xì)胞中病毒miRNA(hsv—miR—H1～hsv—miR—H6)的相對(duì)量。 結(jié)果：在正常細(xì)胞中病毒miRNA均無(wú)表達(dá)；在HSV-1感染HCE細(xì)胞中僅hsv1-miR—H6有表達(dá)，其它miRNA無(wú)表達(dá)或表達(dá)非常低，且以MOI=0.1組作為對(duì)照時(shí)，MOI為5時(shí)hsv1-miR—H6的相對(duì)量為其的4.86倍，MOI為1時(shí)h