精氨酸酶調控奶牛乳腺中酪蛋白合成的分子機制.pdf

1、課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)精氨酸對奶牛乳腺上皮細胞中酪蛋白合成具有促進作用，并且對精氨酸代謝相關酶活力也有顯著影響。在此基礎上，本試驗通過向奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)基中添加不同精氨酸代謝相關酶抑制劑，分別抑制精氨酸的不同代謝通路，并檢測細胞中酪蛋白濃度，篩選出精氨酸調控乳腺上皮細胞中酪蛋白表達的關鍵途徑。接著在乳腺上皮細胞培養(yǎng)基中通過補充代謝底物和代謝產物的方法，對篩選出的關鍵代謝途徑進行驗證。最后，在泌乳中期的荷斯坦奶牛上，通過頸靜脈灌注關鍵的精

2、氨酸代謝相關酶抑制劑，并測定奶牛乳中酪蛋白濃度，乳成分、產奶量、飼料中養(yǎng)分的消化率以及血液指標等。旨在探討精氨酸調控奶牛乳腺中酪蛋白合成的關鍵代謝通路，以期為牛奶中乳蛋白提高，乳品質的改善提供一定的基礎數(shù)據(jù)。
　　試驗1:選擇Nω-hydroxy-nor-Arginine(Cayman，nor-NOHA，10006861)作為精氨酸酶特異性抑制劑;二氟甲基鳥氨酸2-(difluoromethyl)ornithine(Sigma，

3、DFMO，D193)作為鳥氨酸脫羧酶抑制劑以及S-(2-氨乙基)異硫脲二氫溴酸鹽2-(2-Aminoethyl) isothiourea dihydrobromide(Sigma，A5879)作為一氧化氮合酶抑制劑。添加不同抑制劑培養(yǎng)后，分別檢測細胞增殖活力，細胞中精氨酸代謝相關酶活力，及細胞中酪蛋白合成的情況。結果發(fā)現(xiàn)添加nor-NOHA和DFMO處理后的細胞增殖活力顯著降低(P＜0.05)，并且細胞中的酪蛋白濃度也有所降低(P＜0.

4、05)。而當添加NOS酶抑制劑處理后，細胞增殖活力及細胞中酪蛋白合成并沒有顯著變化。綜合以上試驗結果提示，精氨酸可能通過“精氨酸—鳥氨酸—多胺”代謝途徑調控乳腺上皮細胞中酪蛋白合成。
　　試驗2:在試驗1的基礎上，試驗2分別向培養(yǎng)基中添加nor-NOHA、nor-NOHA+Orn，nor-NOHA+Arg處理奶牛乳腺上皮細胞，并檢測細胞增殖，細胞中精氨酸代謝相關酶活力及基因表達量，細胞中酪蛋白濃度及基因表達情況，結果發(fā)現(xiàn)添加nor

5、-NOHA處理后，細胞中總的精氨酸酶活力及精氨酸酶的基因表達量顯著降低(P＜0.05)，細胞的增殖活力有所下降(P＜0.05)，并且細胞中酪蛋白濃度及基因表達量也顯著降低(P＜0.05)。而當補充精氨酸處理后，細胞的增殖活力，細胞中精氨酸代謝相關酶活力和酪蛋白合成并沒有顯著變化(P＞0.05)。但是當向培養(yǎng)基中補充鳥氨酸處理后，細胞的增殖活力有所上升(P＜0.05)，并且上皮細胞中酪蛋白濃度也均有所恢復(P＜0.05)。體外細胞試驗結果

6、初步提示“精氨酸—烏氨酸”代謝通路是調控乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的關鍵通路。
　　試驗3:在泌乳中期的荷斯坦奶牛中，通過頸靜脈灌注nor-NOHA，nor-NOHA+Arg后，檢測奶牛血液中精氨酸代謝相關酶活力，泌乳奶牛產奶量，乳品質，乳中酪蛋白濃度，乳腺中酪蛋白基因以及精氨酸轉運載體蛋白基因表達量。結果發(fā)現(xiàn)，頸靜脈灌注nor-NOHA后，奶牛血液中總精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶活力顯著降低(P＜0.05)，而總的NO合酶的活力卻沒有顯

7、著變化(P＞0.05)，乳中乳蛋白率及乳脂率也有所降低(P＜0.05)，但是產奶量卻沒有變化(P＞0.05);此外乳中酪蛋白濃度及乳腺中酪蛋白基因表達量也有所下降(P＜0.05)，但是乳腺中精氨酸轉運載體蛋白的基因表達量卻沒有顯著變化(P＞0.05)。而當補充灌注精氨酸處理后，奶牛血液中總精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶活力沒有顯著變化(P＞0.05)，但是總的NO合酶活力顯著上升(P＜0.05)，而乳中乳蛋白率，乳脂率和酪蛋白濃度卻沒有顯著變化

8、(P＞0.05)，此外當補充灌注精氨酸后，奶牛乳腺中部分精氨酸轉運載體的基因表達量有了顯著上升(P＜0.05)，奶牛的產奶量也有所提高(P＜0.05)。動物在體試驗得出與體外細胞試驗一致的結論，即精氨酸通過“精氨酸—鳥氨酸”代謝通路調控酪蛋白生成。
　　試驗4:本試驗主要是研究灌注nor-NOHA和nor-NOHA+Arg處理后，奶牛飼料消化率，奶牛體內氮素循環(huán)以及奶牛血液指標的變化。具體試驗方法同試驗3。本試驗發(fā)現(xiàn)，灌注nor-

9、NOHA對飼料中養(yǎng)分的表觀消化率沒有顯著影響(P＞0.05)，但是尿氮的含量卻有所上升(P＜0.05)，而乳氮卻有所下降(P＜0.05)，并且血中尿素氮含量也有所上升(P＜0.05)。而當補充灌注精氨酸后，飼料中粗脂肪的消化率有所提高(P＜0.05)，而尿氮、乳氮和血中尿素氮濃度均恢復至正常水平(P＞0.05)。此外，灌注nor-NOHA和nor-NOHA+Arg對奶牛血常規(guī)指標和免疫球蛋白水平均沒有顯著影響(P＞0.05)。本試驗結果