甘氨酰tRNA合成酶調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成機(jī)理.pdf

1、乳蛋白合成的機(jī)理是重要的生命科學(xué)基礎(chǔ)問(wèn)題之一，近年來(lái)的研究已有一些明顯的進(jìn)展。目前，已發(fā)現(xiàn)催乳素通過(guò)JAK/STAT5信號(hào)通路在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控乳蛋白合成，氨基酸通過(guò)mTOR/S6K1信號(hào)通路在翻譯水平調(diào)控乳蛋白合成。但乳腺細(xì)胞內(nèi)乳蛋白合成還有哪些重要的信號(hào)分子參與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控，什么分子是氨基酸等營(yíng)養(yǎng)素的“分子傳感器”，細(xì)胞核和細(xì)胞液之間的串話如何應(yīng)答氨基酸信號(hào)從而調(diào)節(jié)乳蛋白的合成等，仍是現(xiàn)今泌乳生物學(xué)領(lǐng)域尚待解決的重要科學(xué)問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)較

2、系統(tǒng)全面的研究了甘氨酰tRNA合成酶作為一個(gè)新的信號(hào)分子，接受蛋氨酸信號(hào)，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白(CSN2)合成的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)理。實(shí)驗(yàn)既為人們弄清楚氨基酸對(duì)乳蛋白的調(diào)節(jié)及其作用機(jī)理提供基本理論依據(jù)，也為人們?nèi)媪私馊榈鞍缀铣傻木W(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路提供了一個(gè)新的視野。
　　本研究采用組織塊培養(yǎng)法，培養(yǎng)并純化體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，用蛋白質(zhì)免疫印記(WB)和免疫熒光(IF)檢測(cè)細(xì)胞中角蛋白18(CK18)和C

3、SN2的表達(dá)以鑒定細(xì)胞的純度和泌乳功能。實(shí)驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸，建立了細(xì)胞的泌乳模型，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)、WB和IF等方法，檢測(cè)添加蛋氨酸泌乳模型中，GlyRS的表達(dá)與定位情況。結(jié)果表明，在蛋氨酸促進(jìn)細(xì)胞泌乳時(shí)，GlyRS的表達(dá)顯著上升(p＜0.01)，并且GlyRS的入核也顯著增加(p＜0.01)。這說(shuō)明，在蛋氨酸上調(diào)CSN2表達(dá)的過(guò)程中，GlyRS可能是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。
　　對(duì)

4、GlyRS進(jìn)行過(guò)表達(dá)與干擾，利用qRT-PCR、WB和IF等方法檢測(cè)mTOR、p-mTOR、Stat5a、 p-Stat5a、S6K1、p-S6K1、4EBP1、p-4EBP1和CSN2的表達(dá)，用CASY細(xì)胞活力分析儀和流式細(xì)胞儀分析測(cè)定細(xì)胞活力、細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞的增殖率。結(jié)果顯示，GlyRS過(guò)表達(dá)和干擾后，乳蛋白合成相關(guān)蛋白的磷酸化和CSN2均分別顯著上升和下降(p＜0.01)，細(xì)胞活力、細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞的增殖率也分別顯著增加和減少(p＜0.

5、01)，而乳蛋白合成相關(guān)蛋白的非磷酸化形式無(wú)顯著變化(p＞0.05);添加蛋氨酸后，檢測(cè)的各蛋白的表達(dá)均顯著上升(p＜0.01)，但GlyRS干擾組，添加蛋氨酸不能使相關(guān)磷酸化蛋白和CSN2的表達(dá)恢復(fù)。這說(shuō)明，GlyRS能接受蛋氨酸的信號(hào)，上調(diào)CSN2合成相關(guān)信號(hào)分子的磷酸化、促進(jìn)CSN2的合成及細(xì)胞增殖，且蛋氨酸上調(diào)CSN2合成和促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)很大一部分是由GlyRS接受并傳遞的。
　　構(gòu)建His-GlyRS載體與GlyRS

6、-His載體，提胞漿胞核蛋白，WB檢測(cè)GlyRS的入核及分子剪切。結(jié)果顯示，GlyRS在細(xì)胞中存在3種分子形式，在胞漿中為80-100kDa的全長(zhǎng)形式，在胞核中在近N端剪切，剪切為為10-15kDa和60-80kDa的兩個(gè)分子形式。這說(shuō)明，在GlyRS的入核過(guò)程中存在分子剪切，且剪切位點(diǎn)在N端。運(yùn)用生物信息學(xué)手段分析GlyRS序列中可能的NLS序列，結(jié)果顯示，在GlyRS氨基酸序列中，有RKLK(79-82)和KARKR(99-103)

7、序列，基本符合NLS的經(jīng)典通式K-(K/R)-X-(K/R)和R/K-X(10-12)-R-R-K-K，可能為GlyRS的NLS。用氨基酸點(diǎn)突變技術(shù)，將預(yù)測(cè)的NLS中的堿性氨基酸（R和K）分別突變成丙氨酸(A)，IF檢測(cè)氨基酸點(diǎn)突變后GlyRS的定位變化，結(jié)果表明RKLK(79-82)和KARKR(99-103)序列中任意一個(gè)堿性氨基酸（R和K）的突變均導(dǎo)致GlyRS不能入核。綜合上述結(jié)果說(shuō)明，GlyRS在細(xì)胞中存在分子剪切，GlyRS

8、在細(xì)胞漿中為全長(zhǎng)蛋白，在胞核中，在近N端斷開，剪切成10-15kda和60-80kda兩個(gè)片段。GlyRS序列中79-82、99-103這兩段序列是NLS。
　　用免疫共沉淀(Co-IP)、液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜鑒定(L/MS)和激光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）等技術(shù)，鑒定胞漿中GlyRS的互作蛋白有113個(gè)，在胞核中GlyRS的互作蛋白有41個(gè)，并且在胞核中，GlyRS在544位蘇氨酸(T544)和704位絲氨酸(S704)處有磷酸化。胞漿互

9、作蛋白中，實(shí)驗(yàn)選擇真核翻譯延長(zhǎng)因子1A1(eEF1A1)和真核翻譯起始因子2D(eIF2D)作為目標(biāo)蛋白繼續(xù)研究;胞核互作蛋白中，選擇核轉(zhuǎn)錄因子NFκB1作為目標(biāo)蛋白繼續(xù)研究。應(yīng)用定量免疫共沉淀和激光共聚焦共定位等技術(shù)，檢測(cè)添加蛋氨酸對(duì)GlyRS與eEF1A1、eIF2D和NFκB1互作的影響。結(jié)果顯示，添加蛋氨酸泌乳模型中，GlyRS與eEF1A1的結(jié)合顯著減少(p＜0.01)，與eIF2D、NFκB1的結(jié)合顯著增加(p＜0.01)。

10、對(duì)GlyRS進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾，WB檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，GlyRS過(guò)表達(dá)后，eIF2D、NFκB1和CSN2的表達(dá)顯著增加(p＜0.01)，eEF1A1的表達(dá)無(wú)顯著變化(p＞0.05); GlyRS干擾后，eIF2D、 NFκB1和CSN2的表達(dá)顯著下降(p＜0.01)，eEF1A1的表達(dá)無(wú)顯著變化(p＞0.05)。這說(shuō)明，eIF2D和NFκB1可能參與GlyRS對(duì)CSN2合成的調(diào)節(jié)，而eEF1A1可能不參與此調(diào)節(jié)過(guò)程。對(duì)N

11、FκB1進(jìn)行過(guò)表達(dá)，WB檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，NFκB1過(guò)表達(dá)后，CSN2的表達(dá)顯著增加(p＜0.01)。這說(shuō)明，NFκB1對(duì)細(xì)胞中的CSN2的合成有正向調(diào)節(jié)作用。綜合上述結(jié)果說(shuō)明，GlyRS在胞漿中與eIF2D結(jié)合，從翻譯水平上調(diào)CSN2的表達(dá)，在胞核中與NFκB1結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)CSN2的表達(dá)。
　　根據(jù)質(zhì)譜的磷酸化位點(diǎn)鑒定結(jié)果，突變GlyRS的磷酸化位點(diǎn)，IF檢測(cè)氨基酸點(diǎn)突變后GlyRS的定位變化，結(jié)果表明，

12、T544和S704任意一個(gè)位點(diǎn)突變成丙氨酸后，GlyRS均不能入核，這說(shuō)明，GlyRS入核的機(jī)制可能如下:GlyRS接受蛋氨酸信號(hào)，T544和S704發(fā)生磷酸化，磷酸化的GlyRS由核引導(dǎo)序列引導(dǎo)入核。
　　應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)的方法，檢測(cè)GlyRS、NFκ1與CSN2啟動(dòng)子的結(jié)合。結(jié)果顯示，GlyRS不與CSN2的啟動(dòng)子結(jié)合，而NFκB1與CSN2的啟動(dòng)子結(jié)合，其結(jié)合區(qū)域在CSN2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-1065～-15

13、43區(qū)間內(nèi)。這說(shuō)明，在蛋氨酸調(diào)節(jié)泌乳過(guò)程中，GlyRS入核后并不直接與CSN2啟動(dòng)子結(jié)合，而是通過(guò)與NFκB1的互作，促進(jìn)NFκB1與CSN2啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)上調(diào)CSN2的表達(dá)。
　　綜上所述，GlyRS作為一個(gè)重要信號(hào)分子，能接受氨基酸（如蛋氨酸）信號(hào)，正向調(diào)節(jié)CSN2合成，其可能的調(diào)控機(jī)制如下:GlyRS接受氨基酸（如蛋氨酸）后，一部分在胞漿中與eIF2D結(jié)合，在翻譯水平上上調(diào)CSN2的表達(dá)，一部分在544位蘇氨酸和704位絲氨