奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離鑒定及DBP誘導(dǎo)β-酪蛋白的分泌研究.pdf

1、乳腺生物反應(yīng)器充分利用動(dòng)物乳腺組織具有合成和分泌乳汁的功能，目前被廣泛使用于生產(chǎn)功能蛋白等，現(xiàn)已成為極具開發(fā)應(yīng)用前景的生物技術(shù)。乳腺上皮細(xì)胞是乳腺組織中特異性具有分泌功能的細(xì)胞，在體外分離培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞同樣擁有與在體內(nèi)組織相似的分泌功能，建立乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)為研究乳腺組織的泌乳機(jī)理、驗(yàn)證和檢測(cè)乳腺特異表達(dá)載體功能具有重要意義。
　　本研究對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，并用鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的

2、乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)β-酪蛋白。論文的研究?jī)?nèi)容主要包括兩個(gè)部分:
　　1.利用泌乳期的奶牛乳腺組織，在體外進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的分離、純化和鑒定。本研究利用組織塊培養(yǎng)法、酶消化培養(yǎng)法、機(jī)械培養(yǎng)法進(jìn)行分離細(xì)胞，利用差速貼壁結(jié)合差速脫壁純化分離的乳腺上皮細(xì)胞。對(duì)分離細(xì)胞的顯微觀察表明，三種方法培養(yǎng)細(xì)胞可以獲得成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞混合生長(zhǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)完整;差速脫壁法和差速貼壁法結(jié)合純化細(xì)胞，成纖維樣細(xì)胞完全消失，所得細(xì)胞全部為為鵝卵

3、石狀或卵圓形的上皮樣細(xì)胞。純化的細(xì)胞傳代培養(yǎng)，細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察、生長(zhǎng)曲線繪制、核型制備，結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)良好、具有正常的上皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)正常并且核型完整、有正常的染色體數(shù)目。應(yīng)用免疫熒光方法鑒定乳腺上皮細(xì)胞特異表達(dá)的角蛋白5、角蛋白8和角蛋白18的表達(dá)情況，研究表明，純化的細(xì)胞表達(dá)特異性角蛋白5、8、18并且其表達(dá)率達(dá)到90％。PCR檢測(cè)牛乳腺上皮細(xì)胞β-casein在mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果表明，所培養(yǎng)的細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)β

4、-酪蛋白。
　　2.研究DBP對(duì)乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白分泌誘導(dǎo)作用。β-酪蛋白是乳腺中高表達(dá)的乳蛋白成分，本實(shí)驗(yàn)中利用中草藥王不留行的活性單體DBP來誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的表達(dá)，以添加胰島素、氫化可的松、胰島素樣生長(zhǎng)因子、催乳素的無血清培養(yǎng)液為對(duì)照的誘導(dǎo)液組。首先分別用0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/m

5、l濃度的DBP處理液培養(yǎng)細(xì)胞。MTT比色檢測(cè)結(jié)果表明0.4-0.8(mg/ml)濃度時(shí)細(xì)胞增殖明顯。細(xì)胞經(jīng)0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml DBP誘導(dǎo)液和對(duì)照組誘導(dǎo)液培養(yǎng)，顯微觀察細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)液對(duì)細(xì)胞的活率的影響，結(jié)果表明細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，均無明顯差異。牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)不同誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞β-酪蛋白在mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果表明，經(jīng)0.5 mg/ml的DBP誘導(dǎo)液培養(yǎng)的牛