奶牛乳腺上皮細胞中賴氨酸蛋氨酸配比模式對酪蛋白合成的影響及機理研究.pdf

1、本研究的主要目的是以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型,研究賴氨酸、蛋氨酸及賴氨酸蛋氨酸配比模式對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的影響,旨在探討體外培養(yǎng)條件下乳蛋白合成的最佳賴氨酸蛋氨酸配比模式,揭示在最佳配比模式下轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上影響乳蛋白合成的分子機制,以提高乳中乳蛋白的含量,從而為改善牛奶質(zhì)量提供理論依據(jù)。研究包括三部分:
　　 1.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型,利用噻唑藍(MTT)法來探討不同濃度梯度的賴氨酸

2、、蛋氨酸添加水平及培養(yǎng)時間對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響,得出賴氨酸、蛋氨酸作用的最佳濃度范圍和最優(yōu)的培養(yǎng)時間為后續(xù)實驗做參考,同時也為闡明二者提高奶牛乳腺上皮細胞增殖的機制提供數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。試驗采用完全隨機設(shè)計,賴氨酸在培養(yǎng)基中的添加濃度分別為0、0.05、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6mmol／L,蛋氨酸在培養(yǎng)基中的添加濃度分別為0、0.025、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6

3、、3.2、6.4、12.8mmol／L;培養(yǎng)期為24、48和72h。試驗重復(fù)3次。結(jié)果表明:賴氨酸在0.8～1.6mmol／L、蛋氨酸在0.4～0.8mmol／L濃度范圍內(nèi)對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞增殖的促進作用最明顯且在48h時增殖作用最強(P<0.01)。
　　 2.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型,研究添加賴氨酸、蛋氨酸對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白合成的影響。試驗選擇七種水平的賴氨酸(0、0.4、0.8、1.2、

4、1.6、2.0、2.4mmol／L)和六種水平的蛋氨酸(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol／L)為處理組。試驗期為48h,每個處理3個重復(fù),試驗重復(fù)3次。采用ELISA方法檢測試驗組乳腺上皮細胞中總酪蛋白的含量。通過擬合曲線得出最佳的賴氨酸、蛋氨酸添加水平,同時采用熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)染色法檢測賴氨酸、蛋氨酸在最佳添加水平時對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響；并采用Real-Time P

5、CR技術(shù)檢測此水平下編碼乳蛋白基因、與乳蛋白合成轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的基因以及賴氨酸、蛋氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)運載體CAT-1和ASCT-2的表達。結(jié)果表明:1)以酪蛋白的合成量(y)為縱坐標(biāo),賴氨酸的濃度(x)為橫坐標(biāo),擬合曲線y=-0.336X2+0.792X+1.983(R2=0.965),得出賴氨酸的最佳添加濃度為1.2mmol／L。此水平下,與對照組相比促進了奶牛乳腺上皮細胞的增殖。αs1-酪蛋白(αs1--casein,CSN1S1)、αs

6、2-酪蛋白(αs2-casein,CSN1S2)、β-酪蛋白(β-casein,CSN2)、κ-酪蛋白(κ-casein,CSN3)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin,LALBA)基因表達均上調(diào),且與未添加賴氨酸的對照組相比差異極顯著(P<0.01)。賴氨酸轉(zhuǎn)運載體CAT-1基因的表達上調(diào)且差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白合成轉(zhuǎn)錄相關(guān)的STAT5-JAK2信號通路的基因,信號轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transdu

7、cers and activators of transcription5,STAT5)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2(Janus Kinases2,JAK2)、ets結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子5(ets domain transcription factor,ELF5)表達均顯著上調(diào),且STAT5和JAK2差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白翻譯相關(guān)的哺乳動物雷帕霉素標(biāo)靶(mammalian target ofrapamycin,mTOR)信號通路的基因m

8、TOR和p70核糖體蛋白S6激酶(ribosomal proton S6 kinase-1,S6K)基因的表達均上調(diào)且mTOR差異極顯著(P<0.01),但真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(Eukaryotic translation initiation factor4E binding protein1,EIF4E-BP1)表達下調(diào)。2)以酪蛋白的合成量(y)為縱坐標(biāo),蛋氨酸的濃度(x)為橫坐標(biāo),擬合曲線),y=-2.736X2+2.

9、851X+1.984(R2=0.95),得出蛋氨酸的最佳添加濃度為0.5mmol／L。此水平下,與對照組相比促進了奶牛乳腺上皮細胞的增殖。CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA基因表達均上調(diào):除CSN2外,其他基因與未添加蛋氨酸的對照組相比差異極顯著(P<0.01)。蛋氨酸轉(zhuǎn)運載體ASCT-2基因的表達上調(diào)且差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白轉(zhuǎn)錄相關(guān)的STATS-JAK2信號通路的基因STATS、JAK2、ELF5

10、表達均顯著上調(diào),且STATS和JAK2差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白翻譯相關(guān)的mTOR信號通路的基因mTOR和S6K基因的表達均上調(diào)但差異不顯著,但EIF4E-BP1表達下調(diào)且差異極顯著(P<0.01)。
　　 3.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型,研究賴氨酸蛋氨酸配比模式對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白合成的影響。試驗采用3×5復(fù)因子試驗設(shè)計,以蛋氨酸(0.4、0.5、0.6mmol／L)和賴氨酸(1.0、1.2、1

11、.4、1.5、1.6mmol／L,)的混合物作為試驗處理。試驗期為48h,每個處理3個重復(fù),試驗重復(fù)3次。通過ELISA方法檢測添加蛋氨酸和賴氨酸混合物后細胞中酪蛋白的合成量。得出最佳的賴氨酸蛋氨酸配比模式,并采用Real-Time PCR技術(shù)檢測此水平下乳蛋白基因、與乳蛋白合成轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的基因以及與賴氨酸、蛋氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)運載體CAT-1和ASCT-2的表達。結(jié)果表明:蛋氨酸(0.4mmol／L)和賴氨酸(1.2mmol／L)混合添

12、加時奶牛乳腺上皮細胞總酪蛋白合成量最高為2.95ppm,并差異極顯著(P<0.01)。當(dāng)賴氨酸和蛋氨酸以1.2mmol／L和0.4mmol／L即3:1混合添加時在不影響賴氨酸、蛋氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)運載體CAT-1和ASCT-2基因表達的條件下(P>0.05)均能極顯著地促進乳蛋白基因的表達如:CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA基因表達均上調(diào)(P<0.01),且CSN1S1和LABA表達量最高。與乳蛋白轉(zhuǎn)錄相關(guān)的STAT