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文檔簡介
1、本研究的主要目的是以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型,研究賴氨酸、蛋氨酸及賴氨酸蛋氨酸配比模式對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的影響,旨在探討體外培養(yǎng)條件下乳蛋白合成的最佳賴氨酸蛋氨酸配比模式,揭示在最佳配比模式下轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上影響乳蛋白合成的分子機制,以提高乳中乳蛋白的含量,從而為改善牛奶質(zhì)量提供理論依據(jù)。研究包括三部分:
1.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型,利用噻唑藍(MTT)法來探討不同濃度梯度的賴氨酸
2、、蛋氨酸添加水平及培養(yǎng)時間對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響,得出賴氨酸、蛋氨酸作用的最佳濃度范圍和最優(yōu)的培養(yǎng)時間為后續(xù)實驗做參考,同時也為闡明二者提高奶牛乳腺上皮細胞增殖的機制提供數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。試驗采用完全隨機設(shè)計,賴氨酸在培養(yǎng)基中的添加濃度分別為0、0.05、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6mmol/L,蛋氨酸在培養(yǎng)基中的添加濃度分別為0、0.025、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6
3、、3.2、6.4、12.8mmol/L;培養(yǎng)期為24、48和72h。試驗重復(fù)3次。結(jié)果表明:賴氨酸在0.8~1.6mmol/L、蛋氨酸在0.4~0.8mmol/L濃度范圍內(nèi)對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞增殖的促進作用最明顯且在48h時增殖作用最強(P<0.01)。
2.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型,研究添加賴氨酸、蛋氨酸對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白合成的影響。試驗選擇七種水平的賴氨酸(0、0.4、0.8、1.2、
4、1.6、2.0、2.4mmol/L)和六種水平的蛋氨酸(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L)為處理組。試驗期為48h,每個處理3個重復(fù),試驗重復(fù)3次。采用ELISA方法檢測試驗組乳腺上皮細胞中總酪蛋白的含量。通過擬合曲線得出最佳的賴氨酸、蛋氨酸添加水平,同時采用熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)染色法檢測賴氨酸、蛋氨酸在最佳添加水平時對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響;并采用Real-Time P
5、CR技術(shù)檢測此水平下編碼乳蛋白基因、與乳蛋白合成轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的基因以及賴氨酸、蛋氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)運載體CAT-1和ASCT-2的表達。結(jié)果表明:1)以酪蛋白的合成量(y)為縱坐標(biāo),賴氨酸的濃度(x)為橫坐標(biāo),擬合曲線y=-0.336X2+0.792X+1.983(R2=0.965),得出賴氨酸的最佳添加濃度為1.2mmol/L。此水平下,與對照組相比促進了奶牛乳腺上皮細胞的增殖。αs1-酪蛋白(αs1--casein,CSN1S1)、αs
6、2-酪蛋白(αs2-casein,CSN1S2)、β-酪蛋白(β-casein,CSN2)、κ-酪蛋白(κ-casein,CSN3)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin,LALBA)基因表達均上調(diào),且與未添加賴氨酸的對照組相比差異極顯著(P<0.01)。賴氨酸轉(zhuǎn)運載體CAT-1基因的表達上調(diào)且差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白合成轉(zhuǎn)錄相關(guān)的STAT5-JAK2信號通路的基因,信號轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transdu
7、cers and activators of transcription5,STAT5)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2(Janus Kinases2,JAK2)、ets結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子5(ets domain transcription factor,ELF5)表達均顯著上調(diào),且STAT5和JAK2差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白翻譯相關(guān)的哺乳動物雷帕霉素標(biāo)靶(mammalian target ofrapamycin,mTOR)信號通路的基因m
8、TOR和p70核糖體蛋白S6激酶(ribosomal proton S6 kinase-1,S6K)基因的表達均上調(diào)且mTOR差異極顯著(P<0.01),但真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(Eukaryotic translation initiation factor4E binding protein1,EIF4E-BP1)表達下調(diào)。2)以酪蛋白的合成量(y)為縱坐標(biāo),蛋氨酸的濃度(x)為橫坐標(biāo),擬合曲線),y=-2.736X2+2.
9、851X+1.984(R2=0.95),得出蛋氨酸的最佳添加濃度為0.5mmol/L。此水平下,與對照組相比促進了奶牛乳腺上皮細胞的增殖。CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA基因表達均上調(diào):除CSN2外,其他基因與未添加蛋氨酸的對照組相比差異極顯著(P<0.01)。蛋氨酸轉(zhuǎn)運載體ASCT-2基因的表達上調(diào)且差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白轉(zhuǎn)錄相關(guān)的STATS-JAK2信號通路的基因STATS、JAK2、ELF5
10、表達均顯著上調(diào),且STATS和JAK2差異極顯著(P<0.01)。與乳蛋白翻譯相關(guān)的mTOR信號通路的基因mTOR和S6K基因的表達均上調(diào)但差異不顯著,但EIF4E-BP1表達下調(diào)且差異極顯著(P<0.01)。
3.以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型,研究賴氨酸蛋氨酸配比模式對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白合成的影響。試驗采用3×5復(fù)因子試驗設(shè)計,以蛋氨酸(0.4、0.5、0.6mmol/L)和賴氨酸(1.0、1.2、1
11、.4、1.5、1.6mmol/L,)的混合物作為試驗處理。試驗期為48h,每個處理3個重復(fù),試驗重復(fù)3次。通過ELISA方法檢測添加蛋氨酸和賴氨酸混合物后細胞中酪蛋白的合成量。得出最佳的賴氨酸蛋氨酸配比模式,并采用Real-Time PCR技術(shù)檢測此水平下乳蛋白基因、與乳蛋白合成轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的基因以及與賴氨酸、蛋氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)運載體CAT-1和ASCT-2的表達。結(jié)果表明:蛋氨酸(0.4mmol/L)和賴氨酸(1.2mmol/L)混合添
12、加時奶牛乳腺上皮細胞總酪蛋白合成量最高為2.95ppm,并差異極顯著(P<0.01)。當(dāng)賴氨酸和蛋氨酸以1.2mmol/L和0.4mmol/L即3:1混合添加時在不影響賴氨酸、蛋氨酸相關(guān)的轉(zhuǎn)運載體CAT-1和ASCT-2基因表達的條件下(P>0.05)均能極顯著地促進乳蛋白基因的表達如:CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA基因表達均上調(diào)(P<0.01),且CSN1S1和LABA表達量最高。與乳蛋白轉(zhuǎn)錄相關(guān)的STAT
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