CIDEC基因?qū)δ膛Ｈ橄偃橹铣傻恼{(diào)控研究.pdf

1、乳脂是牛奶的主要營養(yǎng)成分之一，能夠為人類提供營養(yǎng)和能量，因而生產(chǎn)具有足夠乳脂的優(yōu)質(zhì)牛奶是健康食品的發(fā)展趨勢。但是我國牛奶中乳脂的含量普遍偏低，嚴(yán)重降低了乳制品在國內(nèi)外市場的競爭力，因此提高乳產(chǎn)量及乳脂含量成為我們亟待解決的問題。
　　誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的DFF45樣因子C(Cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-likeeffector c，CIDEC)是在脂肪細(xì)胞中大量表達(dá)的一種蛋白質(zhì)

2、，具有促進(jìn)能量儲備、抑制脂肪分解、誘導(dǎo)大脂滴形成，參與全身能量的平衡與調(diào)控的功能。泌乳奶牛乳腺是脂類合成旺盛的場所，但在泌乳奶牛乳腺中，CIDEC的表達(dá)以及其在乳脂合成中的作用還不明確。
　　為研究CIDEC的表達(dá)與乳脂合成之間的關(guān)系，本研究首先通過qRT-PCR、原位雜交、Western bolt和免疫熒光方法分別在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測了CIDEC在泌乳期高乳品質(zhì)、泌乳期低乳品質(zhì)和干奶期奶牛乳腺組織中的表達(dá)含量和表達(dá)部位變化，

3、結(jié)果顯示CIDEC在泌乳期高乳品質(zhì)的乳腺組織中的表達(dá)顯著高于泌乳期低泌品質(zhì)和干奶期的奶牛乳腺組織(P＜0.05)。CIDEC的表達(dá)部位主要位于泌乳乳腺的腺泡上皮細(xì)胞這一結(jié)果提示CIDEC的表達(dá)與乳腺泌乳相關(guān)。隨后通過基因過表達(dá)和干擾的方法，研究了CIDEC基因過表達(dá)和干擾后奶牛乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯含量的變化，并采用qRT-PCR方法檢測了奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂合成相關(guān)基因，包括脂肪酸從頭合成、去飽和酶基因（ACC、FASN、SCD）、

4、脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運、活化相關(guān)蛋白基因（CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2）、TAG合成酶相關(guān)基因（GPAT、AGPAT6、DGAT1）、以及乳脂合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（PPARγ、PPARGC1A、SREBP1、INSIG1、SCAP）的表達(dá)。結(jié)果顯示CIDEC基因過表達(dá)后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中TAG合成量增加、脂滴體積變大、數(shù)量增多、乳脂合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)量升高;而CIDEC基因干擾后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中TAG合成量減少，細(xì)胞內(nèi)

5、脂滴體積變小，數(shù)量減少，乳脂合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)量降低。這些結(jié)果表明CIDEC對奶牛乳腺中乳脂合成具有調(diào)節(jié)作用。
　　為進(jìn)一步研究泌乳奶牛乳腺中調(diào)節(jié)CIDEC表達(dá)、進(jìn)而調(diào)節(jié)乳脂合成的信號通路，我們在奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加8 mmol/L乙酸鈉和1 mmol/L BHBA，誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞中CIDEC的表達(dá)和乳脂的合成，并采用Western blot方法研究了mTOR信號通路AMPK信號通路分子的表達(dá)。結(jié)果顯示添加8 m

6、mol/L乙酸鈉和1 mmol/L BHBA能明顯上調(diào)mTOR信號通路下游分子4EBP1、p-4EBP1、P70S6K、p-P70S6K的表達(dá);同時還可以誘導(dǎo)細(xì)胞中AMPKα的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，降低pAMPK的表達(dá);表明在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，CIDEC的表達(dá)受mTOR信號通路和AMPK信號通路的調(diào)節(jié)。
　　為進(jìn)一步研究奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CIDEC調(diào)節(jié)乳脂合成的分子機(jī)制，我們采用基因超表達(dá)和干擾的方法改變了細(xì)胞中PPA Rγ

7、的表達(dá)水平，分析了PPARγ超表達(dá)和干擾以后奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CIDEC表達(dá)和甘油三酯含量的變化，并研究了PPARγ過表達(dá)同時干擾CIDEC后，乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯含量的變化。結(jié)果顯示PPARγ通過調(diào)節(jié)CIDEC的表達(dá)來調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯的合成。隨后采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)篩選出CIDEC的啟動子核心區(qū)域在-100--40bp區(qū)段。通過軟件分析，預(yù)測該位置包含RXRα的結(jié)合位點。最后采用ChIP-PCR技術(shù)進(jìn)一步確定了上游轉(zhuǎn)