雪卡毒素單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、雪卡毒素是一種來(lái)源于岡比爾盤藻并通過(guò)食物鏈在珊瑚魚(yú)體內(nèi)富集的毒素。全世界每年約50000人遭受雪卡毒素中毒的困擾,因而建立一種快速有效的檢測(cè)方法成為科學(xué)家共同關(guān)注的課題。本論文利用雪卡毒素結(jié)構(gòu)類似物莫能菌素為半抗原,合成雪卡毒素人工抗原并免疫小鼠,制備雜交瘤誘導(dǎo)腹水并獲得高效價(jià)高特異性的單克隆抗體,建立雪卡毒素的免疫分析方法。
　　 分別采用混合酸酐法和碳二亞胺法(EDC)將莫能菌素半抗原與牛血清白蛋白(BSA)和雞血清蛋白(O

2、VA)偶聯(lián),合成莫能菌素人工免疫抗原和包被抗原。以免疫抗原免疫Balb／c小鼠3次后測(cè)定血清抗體效價(jià)及特異性。取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2／0進(jìn)行融合制備雜交瘤,依據(jù)效價(jià)和特異性高的原則篩選并進(jìn)行4次有限稀釋亞克隆篩選,建立穩(wěn)定的細(xì)胞株。通過(guò)體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體,收集腹水并采用辛酸硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化,SDS-PAGE和紫外分光光度法鑒定抗體純度和含量。建立雪卡毒素間接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)方法,并鑒

3、定雪卡毒素單克隆抗體的特異性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)經(jīng)TLC及SDS-PAGE鑒定成功合成了雪卡毒素的人工免疫抗原及包被抗原,其中莫能菌素分子與BSA和OVA的偶聯(lián)比分別為18.5:1和7:1。(2)獲得3株穩(wěn)定分泌抗雪卡毒素抗體的雜交瘤細(xì)胞株1D5、2G11、3G11,且3株細(xì)胞分泌的抗體均屬于IgG1亞型,輕鏈為κ鏈。(3)腹水抗體純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定有兩條帶,一條為重鏈,約55KD,另一條為輕鏈,約28KD。獲得

4、較純的腹水單抗,其蛋白含量約為4.127mg／mL。(4)建立的雪卡毒素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA條件為:包被抗原5μg／mL,37℃包被2h；3％脫脂奶粉封閉1h；一抗稀釋倍數(shù)1:6400；甲醇濃度10％；板外競(jìng)爭(zhēng)；二抗工作濃度1:10000；顯色15min。(5)建立的雪卡毒素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=10.722x+25.399,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9939,最低檢測(cè)限為0.12ng／mL。檢測(cè)范圍為0.12ng／mL～15.