LRRN3的組織表達及其對小腦出生后發(fā)育調(diào)控的研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育機制的研究是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的一個重要內(nèi)容，發(fā)育機制的闡明將為許多老年性疾病、發(fā)育畸形以及神經(jīng)損傷后修復(fù)等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的防治帶來曙光。發(fā)育過程受到許多因素的調(diào)控，基因調(diào)控是其中的重要部分，基因及其表達產(chǎn)物可通過不同信號通路調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育和分化。
　　 神經(jīng)系統(tǒng)富亮氨酸重復(fù)3(Neuronal L,eucine Rich Repeat3，LRRN3)是神經(jīng)系統(tǒng)富亮氨酸重復(fù)超家族的成員，蛋白結(jié)構(gòu)中包含LRR結(jié)

2、構(gòu)域、IgC2樣結(jié)構(gòu)域以及FNⅢ樣結(jié)構(gòu)域這些與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切的結(jié)構(gòu)域。研究表明LRRN3 mRNA在不同發(fā)育階段的胚胎神經(jīng)系統(tǒng)中存在，提示LRRN3可能在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起作用，但具體作用和機制目前仍不清楚。深入研究LRRN3蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達和功能，將有助于我們進一步了解神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控機制，并為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)疾病的防治提供基礎(chǔ)理論支持。
　　 實驗第一部分借助基因工程技術(shù)制備了兔抗大鼠LRRN3多克隆抗體。運

3、用生物信息學(xué)方法分析LRRN3蛋白的結(jié)構(gòu)，選擇C端一段抗原性強、表面暴露性好的肽段，根據(jù)原核表達載體Mal—pET21a(+)-His閱讀框架設(shè)計引物；以從大鼠腦組織反轉(zhuǎn)錄出的總cDNA為模板擴增出目標片段，與載體連接后在大腸桿菌JM109中擴增；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在E.coli BL21中表達出重組的Mal-LRRN3C-His融合蛋白。以此純化的蛋白為抗原免疫新西蘭兔，制備并純化了兔抗大鼠LRRN3多克隆抗體。經(jīng)ELISA、Wester

4、n Blot和免疫組化檢測，該抗體具有較高的效價和特異性。
　　 實驗第二部分采用兩種方式對LRRN3蛋白的組織表達譜尤其是其在神經(jīng)系統(tǒng)的表達進行了研究。利用現(xiàn)有的互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫資源，運用生物信息學(xué)分析方法，借助基于EST策略的電子雜交方法和基于GEO(Gene Expression Omnibus，基因表達大棚車)數(shù)據(jù)的分析方法對LRRN3的組織表達譜進行了初步預(yù)測。結(jié)果顯示大鼠LRRN3 mRNA主要存在于變態(tài)階段的胚胎及幼年

5、和成年動物中，表達部位主要在腦、脊神經(jīng)根、心、肝和腎等組織。借助免疫組化和Western Blot等實驗手段，研究LRRN3蛋白在大鼠體內(nèi)的表達，結(jié)果顯示，LRRN3蛋白主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦皮質(zhì)多極神經(jīng)元、海馬齒狀回顆粒層細胞以及小腦蒲肯野細胞，神經(jīng)膠質(zhì)細胞中無陽性表達，其它組織沒有明顯陽性表達。實驗結(jié)果表明LRRN3蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)存在密切關(guān)系。
　　 為進一步了解LRRN3蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用，我們重點研究了LR

6、RN3蛋白對大鼠小腦出生后發(fā)育的影響。腹腔注射LRRN3多克隆抗體中和新生大鼠體內(nèi)的內(nèi)源性LRRN3蛋白，借助行為學(xué)實驗、電鏡技術(shù)和免疫組化等實驗手段觀察抗體注射后大鼠小腦形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的改變，從而探討LRRN3蛋白對小腦生后發(fā)育的影響及可能的作用機制。結(jié)果顯示實驗組動物小腦中LRRN3陽性染色的蒲肯野細胞數(shù)和陽性強度明顯低于對照組；實驗組動物平衡能力較對照組差，相同時間點的兩組動物靜態(tài)平衡時間(Balance latency,BL)差

7、異具有顯著性(P<0.05)；透射電鏡結(jié)果顯示實驗組部分蒲肯野細胞出現(xiàn)細胞固縮，細胞周圍和分子層存在水腫，分子層中突觸終末數(shù)量明顯少于對照組；囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體1(Vesicular glutamate transporter1，VGluT1)在對照組和實驗組大鼠出生后P7、P14和P21天小腦中均有表達，從P7、P14到P21天，VGluT1陽性分子層隨發(fā)育進行而不斷增厚，相同時間點的對照組和實驗組動物VGluT1陽性分子層厚度在P7