抑制nNOS蛋白表達對發(fā)育期小腦顆粒細胞的影響.pdf

1、一氧化氮(NO)是一種兼有細胞內(nèi)和細胞間的信使和神經(jīng)遞質(zhì)作用的氣體物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，NO對神經(jīng)系統(tǒng)具有雙重作用。生理情況下，少量NO可發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，病理情況下，大量的一氧化氮合酶(NOS)尤其是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達激活乍成過量的NO，對神經(jīng)元及其組織產(chǎn)生巨大的神經(jīng)毒性作用。NO結(jié)構(gòu)簡單又極不穩(wěn)定，生物半衰期僅5秒左右，因此其直接測定較為困難。體內(nèi)NO主要在NOS專一催化下合成，在研究中我們可通過測檢NOS的量來間接反

2、映NO的量，從而達到研究NO作用的目的。NOS是體內(nèi)專一催化合成NO的酶，根據(jù)組織或細胞來源將NOS分為三型：神經(jīng)元型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。生理狀況下nNOS和eNOS表達，iNOS不表達，其中以nNOS分布最廣泛，主要位于中樞神經(jīng)元，尤其小腦顆粒細胞層和分子層。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中nNOS催化產(chǎn)生的NO主要調(diào)節(jié)發(fā)育期神經(jīng)元的突觸可塑性、信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)。多數(shù)報道認為腦損傷早期nNOS激活并釋放過

3、量的NO與神經(jīng)毒性作用有關(guān)，但是亦有報道認為NO/nNOS具有神經(jīng)保護作用，大鼠局灶性腦缺血再灌注24小時后，位于梗死灶中心區(qū)的nNOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量越多，梗死灶體積越小。大鼠腦部NOS的分布以小腦最多，尤其nNOS大量分布于顆粒細胞層和分子層。由于小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)是小腦中數(shù)量最多的細胞，體外培養(yǎng)方法成熟，易于在體外培養(yǎng)中獲得高純度(>95％)的神經(jīng)元細胞。此外，體外培養(yǎng)的發(fā)育期的CGNs的基因轉(zhuǎn)染效率高于體內(nèi)成熟的CGNs

4、的基因轉(zhuǎn)染效率。因此，本課題建立小腦顆粒細胞神經(jīng)元體外培養(yǎng)，使用反義寡核苷酸(AS-ODN)技術(shù)抑制nNOS的水平，并觀察nNOS被抑制后小腦顆粒細胞神經(jīng)元發(fā)育和存活的變化，從而明確nNOS在神經(jīng)元發(fā)育和存活中的作用。
　　 研究目的:
　　 通過反義寡核苷酸技術(shù)抑制發(fā)育期CGNs中的nNOS，探討nNOS在發(fā)育期小腦顆粒細胞中的作用和地位，了解nNOS在神經(jīng)元生長中所起的作用，為進一步研究NO/nNOS在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中

5、的作用及機制奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.原代CGNs培養(yǎng)：
　　 將出生后7天的SD乳鼠的小腦分離并獲得小腦顆粒細胞，種植于已用多聚賴氨酸包被過夜的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)于含10％小牛血清、100μg/ml慶大霉素、25mmol/L氯化鉀的細胞完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后加入阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元的生長。
　　 2.nNOS AS-ODN設(shè)計合成：
　　 設(shè)計合成nNOS AS-ODN序列，使用

6、隨機序列(R-ODN)作為對照。由Biognostik(GmbH，Goettingen，Germany)公司合成。
　　 3.寡核苷酸(ODN)的細胞毒性測定：
　　 將不同濃度R-ODN加入培養(yǎng)第7天的小腦顆粒細胞，MTT法檢測細胞存活率。
　　 4.AS-ODN有效轉(zhuǎn)染濃度和時間測定：
　　 分別將終濃度為不產(chǎn)生細胞毒性的最高濃度的nNOS AS-ODN和R-ODN加入培養(yǎng)第7天的CGNs中，使用We

7、stern blot檢測小腦顆粒細胞中的nNOS蛋白表達，使用相同濃度的異硫氰酸熒光素標記的R-ODN(FITC-R-ODN)在倒置熒光顯微鏡下觀察ODN進入細胞的情況，測定獲得ODN最高轉(zhuǎn)染效率的最佳濃度和時間。
　　 5.AS-ODN對發(fā)育期CGNs的影響：
　　 RT-PCR檢測nNOS的mRNA水平，Western blot和細胞免疫組化測定nNOS蛋白水平的變化，并從細胞免疫組化的結(jié)果分析發(fā)育中小腦顆粒細胞nN

8、OS的表達。使用MTT法檢測nNOS AS-ODN轉(zhuǎn)染后細胞存活率變化，使用中性紅染色和顯微鏡下觀察計算小腦顆粒細胞存活數(shù)。
　　 6.統(tǒng)計學處理：
　　 所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計方法使用單因素方差分析及Bonferroni多重比較檢驗。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用社會科學統(tǒng)計軟件SPSS11.0完成，檢驗水準定為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.nNOS在發(fā)育期CGNs的表達
　　 體外培養(yǎng)成

9、功獲得純化的原代小腦顆粒細胞神經(jīng)元，使用免疫組化方法在CGNs培養(yǎng)的第7天即可檢出nNOS蛋白表達陽性的CGNs，且隨著時間的推移逐漸增加，nNOS mRNA的表達出現(xiàn)在CGNs培養(yǎng)的第4天，然后逐漸增加，一直持續(xù)到第14天。
　　 2.ODN的的細胞毒性作用
　　 于體外培養(yǎng)7天后分組進行ODN轉(zhuǎn)染處理及后續(xù)實驗。終濃度10μmol/L和20μmol/L的R-ODN處理后的小腦顆粒細胞存活率較對照組明顯下降，顯示10μ

10、mol/L及以上濃度的R-ODN產(chǎn)生顯著細胞毒性作用。
　　 3.AS-ODN最佳轉(zhuǎn)染濃度和轉(zhuǎn)染時間
　　 終濃度8μmol/L的R-ODN處理72小時后，F(xiàn)ITC-R-ODN測定顯示轉(zhuǎn)染效率達到最佳，被熒光標記的培養(yǎng)細胞維持正常的形態(tài)和細胞密度。CGNs培養(yǎng)第7天，F(xiàn)ITC-R-ODN在2小時首次被發(fā)現(xiàn)進入小腦顆粒細胞，攝入的細胞數(shù)在4～8小時增加，在24至48小時內(nèi)，累計超過90％的培養(yǎng)的小腦顆粒細胞攝入了FITC-

11、R-ODN，自72小時始逐漸減少。
　　 4.nNOS AS-ODN抑制發(fā)育期CGNs的nNOS蛋白表達
　　 使用8μmol/L的nNOS AS-ODN處理72小時后，小腦顆粒細胞nNOS的mRNA水平無明顯變化，但是蛋白的表達較相同濃度的R-ODN對照組下降了大約59％，較陰性對照的TE緩沖液組下降了60％，R-ODN組與TE緩沖液組CGNs的nNOS蛋白表達無顯著性差異。
　　 5.nNOS AS-ODN降

12、低發(fā)育期小腦顆粒細胞的存活率
　　 MTT法檢測細胞存活率發(fā)現(xiàn)，nNOS AS-ODN轉(zhuǎn)染后小腦顆粒細胞存活率較對照組顯著降低。中性紅染色計數(shù)結(jié)果亦顯示，nNOS AS-ODN轉(zhuǎn)染后存活的小腦顆粒細胞計數(shù)較對照組明顯減少，結(jié)果有顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.體外成功培養(yǎng)了原代發(fā)育期小腦顆粒細胞。
　　 2.nNOS蛋白在小腦顆粒細胞培養(yǎng)的第7～14天表達并隨時間延長而增加。
　　 3.nN