青春期前雙酚A暴露對(duì)大鼠卵泡發(fā)育的影響及其相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控.pdf

1、雙酚A(BisphenolA,BPA)學(xué)名2,2-二(4-羥基苯基)丙烷,是世界已知重要的環(huán)境雌激素之一。BPA是人工合成的高分子材料的單體,是生產(chǎn)塑料增塑劑、農(nóng)藥、涂料等化工產(chǎn)品的原料。在嬰兒奶瓶、飯盒、玩具及自來水管等材料中廣泛存在。雙酚A單體可從盛裝食物或飲料的塑料容器中游離出來,在高溫或強(qiáng)酸堿等條件下可加速游離過程。BPA暴露人群非常廣泛,流行病學(xué)研究表明,超過90％的個(gè)體尿中可檢測到BPA。BPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)與乙烯雌酚類似,進(jìn)入

2、體內(nèi)可模擬雌激素活性。
　　目前歐盟、美國和中國等眾多國家只是禁止含BPA的塑料用于制造嬰兒奶瓶,實(shí)際上,青春期前的兒童BPA暴露也是一個(gè)值得關(guān)注的問題。這個(gè)時(shí)期是生殖系統(tǒng)發(fā)育成熟前的一個(gè)關(guān)鍵階段。這個(gè)時(shí)期的兒童可能通過多種途徑暴露于BPA,特別是發(fā)生食品和飲水污染事件時(shí),兒童還可能會(huì)短期暴露于較高濃度的BPA。盡管環(huán)境雌激素與天然激素相比在體內(nèi)的濃度較低,但由于處于發(fā)育期的兒童下丘腦-垂體-性腺軸尚未發(fā)育成熟,體內(nèi)性激素水平比較

3、低,此時(shí)的個(gè)體對(duì)外源性雌激素的反應(yīng)較成年敏感。同時(shí),較高濃度的BPA對(duì)卵巢發(fā)育的毒性效應(yīng)問題也不容忽視。我們推測,青春期前較高濃度BPA短期暴露很可能會(huì)影響雌性卵泡的正常發(fā)育過程,并且有可能通過影響卵泡發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因而發(fā)揮作用。本研究通過觀察促進(jìn)卵泡發(fā)育的Kitlg、Figla和H1foo基因以及抑制卵泡發(fā)育的AMH基因表達(dá)的表達(dá)和DNA甲基化模式,探討卵巢發(fā)育相關(guān)的基因在大鼠BPA短期暴露所致卵巢發(fā)育毒性中的作用及其分子生物學(xué)機(jī)制,

4、為進(jìn)一步闡明BPA對(duì)兒童生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分:青春期前BPA暴露對(duì)卵巢發(fā)育和功能的影響
　　目的:通過建立青春期前BPA短期暴露的大鼠動(dòng)物模型,觀察BPA對(duì)卵巢形態(tài)、功能,卵泡細(xì)胞的凋亡以及卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等改變,探討青春期前BPA暴露對(duì)卵巢發(fā)育和功能的影響。
　　方法:28日齡雌性wistar大鼠通過腹腔注射BPA(10mg/kg、40mg/kg、160mg/kg),每天染毒1次,連續(xù)染毒1

5、周。觀察卵巢重量、各級(jí)卵泡構(gòu)成、卵泡凋亡(TUNEL)、陰道開放率、第一次動(dòng)情期出現(xiàn)率、血清性激素水平、卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:
　　1.青春期前大鼠BPA暴露后,染毒組大鼠在各個(gè)時(shí)間段的體重與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);BPA染毒組的卵巢重量和臟器系數(shù)隨染毒劑量升高而出現(xiàn)下降,其中40mg/kg和160mg/kgBPA組大鼠卵巢重量與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　2.各染毒劑量

6、組陰道開放率和和首次動(dòng)情期出現(xiàn)率對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3.隨染毒劑量增加,各染毒組大鼠血清雌E2水平有下降趨勢,與對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)。而血清P4水平與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01),其中,40mg/kg和160mg/kgBPA組血清P4水平下降與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　4.隨著染毒劑量升高,各染毒組卵泡數(shù)量呈下降趨勢,其中10mg/kg、40mg

7、/kg和160mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01和P<0.01);始基卵泡、初級(jí)卵泡/腔前卵泡、有腔卵泡和黃體構(gòu)成比均呈下降趨勢,而閉鎖卵泡構(gòu)成比有升高趨勢,其中40mg/kg和160mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　5.隨染毒劑量的增加,各染毒劑量組中,腔前卵泡、有腔卵泡以及黃體/白體凋亡率均呈現(xiàn)上升趨勢,與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.

8、電鏡觀察卵巢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),與對(duì)照組比較,40mg/kgBPA組和160mg/kgBPA組鏡下的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示,細(xì)胞內(nèi)脂肪變性增多,次級(jí)溶酶體增多,尤其在160mg/kgBPA組中,大部分細(xì)胞胞質(zhì)中幾乎都充斥著脂肪顆粒和次級(jí)溶酶體。
　　第二部分:青春期前BPA暴露對(duì)卵泡發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的:青春期前BPA暴露影響卵泡發(fā)育過程中,對(duì)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響,探討B(tài)PA卵巢毒性的分子機(jī)制。
　　方法:整體動(dòng)物模

9、型同前,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot分析以及免疫組化技術(shù)檢測卵泡發(fā)育相關(guān)基因:干細(xì)胞因子(KITLG)、基礎(chǔ)螺旋環(huán)轉(zhuǎn)錄因子(FIGLA)、卵母細(xì)胞特有的H1連結(jié)組蛋白(H1FOO)、抗苗勒激素(AMH)的mRNA及其蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.各染毒劑量組KitlgmRNA相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢,其中160mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.01);各染毒劑量組FiglamRNA

10、相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢,其中160mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.05);各染毒劑量組H1foomRNA相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢,與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.01);各染毒劑量組AMHmRNA相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢,其中40mg/kgBPA組和160mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p﹤0.05和p﹤0.01)。
　　2.Westernblot結(jié)果顯示,KITLG蛋白表達(dá)水平在各BP

11、A染毒組均呈明顯下調(diào),其中10mg/kgBPA組和40mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),160mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);FIGLA蛋白表達(dá)水平在160mg/kgBPA組呈明顯下調(diào),與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);H1FOO蛋白表達(dá)水平在各BPA染毒組均呈明顯下調(diào),其中10mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),40mg/kg和160

12、mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);AMH蛋白表達(dá)水平在各BPA染毒組均呈明顯上調(diào),其中10mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),40mg/kg和160mg/kgBPA組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　第三部分青春期前BPA暴露影響卵泡發(fā)育的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制研究
　　目的:從卵巢細(xì)胞DNA總甲基化狀態(tài)和卵泡發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)兩個(gè)方面

13、,初步探討B(tài)PA的表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:整體動(dòng)物模型同前,卵巢細(xì)胞DNA總甲基化采用免疫組化檢測卵巢細(xì)胞5-甲基胞嘧啶(5-mC)水平。采用亞硫酸氫鹽修飾后測序法(BSP)檢測卵巢發(fā)育相關(guān)基因Kitlg啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀況。
　　結(jié)果:
　　1.隨著染毒劑量的增加,卵巢顆粒細(xì)胞5-mC免疫組化的平均光密度值(OD)和積分光密度值(IOD)呈總體上升趨勢,其中,40mg/kgBPA組和160mg/kg

14、BPA組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.采用Methprimer軟件對(duì)以上全部基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行CpG島檢測,只有Kitlg基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)CpG島,35個(gè)甲基化位點(diǎn)。Kitlg基因BSP產(chǎn)物重組T載體質(zhì)粒的測序結(jié)果顯示,隨著染毒劑量增加,發(fā)生Cs的個(gè)數(shù)呈上升趨勢,其中,160mg/kgBPA組Cs的甲基化率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);第7甲基化位點(diǎn)(Cs)在對(duì)照組存在甲基化狀態(tài),

15、在染毒組中出現(xiàn)較為明顯的去甲基化現(xiàn)象;第16甲基化位點(diǎn)在對(duì)照組呈現(xiàn)無甲基化狀態(tài),而隨著染毒劑量增加,在染毒組中出現(xiàn)較為明顯的甲基化現(xiàn)象。
　　結(jié)論:
　　根據(jù)以上結(jié)果結(jié)合討論可得出如下結(jié)論:
　　1.青春期前BPA較高濃度短期暴露可能對(duì)卵巢卵泡的發(fā)育和性激素分泌功能具有抑制毒效應(yīng),主要表現(xiàn)為卵巢重量及卵巢臟器系數(shù)下降、卵泡總數(shù)下降、生長卵泡構(gòu)成比下降及閉鎖卵泡構(gòu)成比升高、卵泡凋亡率升高、血清孕激素水平下降。