RFRP-3在幼齡綿羊組織中的表達及其參與繁殖營養(yǎng)調(diào)控的研究.pdf

1、RF酰胺相關(guān)肽-3(RFamide-related peptide-3，RFRP-3)是促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)在哺乳動物體內(nèi)的同系物，它對動物的生殖、攝食、應(yīng)激及行為有調(diào)節(jié)作用。RFRP-3/GnIH在許多物種中的基因序列、結(jié)構(gòu)、表達分布以及生物學功能的研究先后被報道。由于RFRP-3具有調(diào)節(jié)動物生殖和攝食的雙重作用，科學家們推測RFRP-3可能參與動物的繁殖營養(yǎng)調(diào)

2、控。目前，對于RFRP-3在綿羊組織中的表達以及其是否參與繁殖營養(yǎng)調(diào)控的研究還未見報道。本試驗以3月齡雌性綿羊為研究對象，在研究RFRP-3基因在幼齡綿羊各組織中的特異性表達及RFRP-3蛋白在幼齡綿羊卵巢組織中表達定位的基礎(chǔ)上，采用限飼的方法首先研究限飼是否影響幼齡綿羊卵巢的發(fā)育，然后研究RFRP-3以及GnRHR、FSHR、LHR基因在下丘腦-垂體-卵巢軸的表達。通過以上研究探討RFRP-3在幼齡綿羊生殖發(fā)育過程中的作用，以及其參與

3、繁殖營養(yǎng)調(diào)控的機制。
　　1.RFEP-3基因在幼齡綿羊各組織中的表達情況
　　應(yīng)用普通PCR和熒光定量PCR檢測RFRP-3基因在幼齡綿羊各組織中表達情況，結(jié)果表明RFRP-3基因在延髓中表達量最高，其次在眼、卵巢、脊髓、子宮和下丘腦等組織中表達量較高，在心、肝、脾、肺和腎等組織中表達量相對較低。這個結(jié)果揭示了RFRP-3在幼齡綿羊各個組織中具有廣泛的分布，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)中表達量相對較高，而在內(nèi)臟及消化系統(tǒng)中表

4、達量較低，這可能與RFRP-3的生物學功能有關(guān)。
　　2.RFRP-3蛋白在幼齡綿羊卵巢組織中的表達定位
　　應(yīng)用免疫組化的方法研究RFRP-3蛋白在幼齡綿羊卵巢的各級卵泡中的表達情況。結(jié)果表明，RFRP-3在各級卵泡的卵母細胞中都有表達。在原始卵泡和初級卵泡的顆粒細胞中沒有發(fā)現(xiàn)RFRP-3的表達。而RFRP-3在次級卵泡的顆粒細胞和卵泡膜細胞中不表達或微弱表達，在三級卵泡的顆粒細胞和卵泡膜細胞中有較強表達。RFRP-3在卵

5、巢間質(zhì)和卵巢膜中有微弱的表達。這個結(jié)果暗示RFRP-3在幼齡綿羊卵巢組織中有特異性分布，可能對卵泡發(fā)育及卵巢功能有調(diào)節(jié)作用。
　　3.限飼對幼齡綿羊卵巢發(fā)育的影響
　　研究高水平限飼（50％自由采食量）和低水平限飼（70％自由采食量）對幼齡綿羊卵巢發(fā)育的影響。結(jié)果表明，經(jīng)過47天的不同水平飼喂，高水平限飼和低水平限飼極顯著降低了幼齡綿羊的卵巢體積、卵巢重和體重。高水平的限飼顯著降低了“卵巢重/體重”的比值。對卵巢組織采用石蠟

6、切片及HE染色后分析結(jié)果表明，限飼對幼齡綿羊的原始卵泡和初級卵泡的數(shù)目影響不顯著。然而，高限飼組極顯著降低了次級卵泡和三級卵泡的數(shù)目。限飼對卵泡閉鎖率的影響不顯著，但是高限飼組顯著降低幼齡綿羊的卵泡募集率。這個結(jié)果證明限飼對幼齡綿羊的卵巢發(fā)育有抑制作用。
　　4.限飼對幼齡綿羊RFRP-3、 GnRHR、FSHR和LHR基因在下丘腦-垂體-卵巢軸表達的影響
　　通過熒光定量PCR研究高水平限飼（50％自由采食量）和低水平限飼

7、（70％自由采食量）對幼齡綿羊下丘腦-垂體-卵巢組織中RFRP-3、GnRHR、FSHR和LHR基因表達的影響。結(jié)果表明:限飼顯著提高RFRP-3在下丘腦-垂體-卵巢軸中的表達。相反，限飼顯著抑制了GnRHR、FSHR和LHR基因在下丘腦-垂體-卵巢軸中的表達。結(jié)果暗示限飼導致RFRP-3的表達上調(diào)，通過RFRP-3抑制下丘腦-垂體-卵巢軸從而抑制卵巢的發(fā)育，進一步驗證了RFRP-3參與繁殖營養(yǎng)調(diào)控。
　　以上試驗結(jié)果證明，RFR