槲皮素對(duì)低氧肺動(dòng)脈高壓的防治作用及其機(jī)制研究.pdf

1、一、槲皮素對(duì)大鼠低氧肺動(dòng)脈高壓防治作用的研究
　　目的：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討槲皮素對(duì)低氧肺動(dòng)脈高壓的作用效果，為肺動(dòng)脈高壓治療尋求新的方式及治療靶點(diǎn)。
　　方法：隨機(jī)將30只雄性Sprague-Dawley大鼠分為常氧組、低氧組、低氧+槲皮素組，每組10只。持續(xù)4周后，在生理多導(dǎo)儀監(jiān)視下，通過(guò)右心漂浮導(dǎo)管測(cè)定大鼠體循環(huán)壓、右心室收縮壓、右心室比重[右心室/(左心室+室間隔)]，免疫組化檢測(cè)各組大鼠肺小動(dòng)脈中PCNA、Ki67以及TU

2、NEL的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：槲皮素可顯著緩解低氧肺動(dòng)脈高壓（P<0.05），逆轉(zhuǎn)右心室肥厚以及肺血管重塑（P<0.05），并導(dǎo)致肺小動(dòng)脈PASMCs增殖減少，凋亡增加。
　　結(jié)論：槲皮素可有效促進(jìn)大鼠PASMCs增殖減少、凋亡增加，緩解低氧肺血管重塑，逆轉(zhuǎn)低氧肺動(dòng)脈高壓。
　　二、槲皮素通過(guò)調(diào)控TrkA/AKT信號(hào)通路緩解低氧肺動(dòng)脈高壓
　　目的：探討槲皮素抑制低氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋

3、亡從而緩解缺氧肺動(dòng)脈高壓的潛在的分子機(jī)制，為槲皮素治療低氧肺動(dòng)脈高壓進(jìn)一步提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：分離、培養(yǎng)大鼠PASMC，在Oxycyclermodel C21低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中建立細(xì)胞低氧模型。MTT法檢測(cè)槲皮素的IC50，流失細(xì)胞法檢測(cè)槲皮素濃度梯度下細(xì)胞周期及凋亡細(xì)胞數(shù)，Western-blot檢測(cè)周期蛋白及凋亡蛋白的變化；Tanswell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槲皮素對(duì)低氧 PASMCs遷移的影響；全組基因芯片篩選低氧 PASMCs增殖

4、、凋亡及遷移的相關(guān)調(diào)控基因變化。
　　結(jié)果：槲皮素可顯著緩解PH（P<0.05），逆轉(zhuǎn)右心室肥厚以及肺血管重塑（P<0.05），并導(dǎo)致肺小動(dòng)脈PASMCs增殖減少，凋亡增加；體外實(shí)驗(yàn)表明：槲皮素能有效抑制低氧 PASMCs增殖，使其周期停滯在 G1/G0期、促進(jìn)其凋亡和遷移；此外，結(jié)果顯示槲皮素能增加低氧PASMCscyclin D1的表達(dá)，同時(shí)減少cyclin B1和Cdc2的表達(dá)；Western-blot結(jié)果顯示槲皮素能逆轉(zhuǎn)低

5、氧所導(dǎo)致的BAX/Bcl-2的比率，同時(shí)減少M(fèi)MP2、MMP9、CXCR4、integrinβ1和integrinα5的表達(dá)；全組基因芯片分析表明槲皮素調(diào)控低氧PASMCs增殖、凋亡、細(xì)胞周期停滯、以及遷移與酪氨酸受體激酶A（TrkA）相關(guān)；低氧激活TrkA/AKT信號(hào)通路，槲皮素可有效抑制該通路的激活，更為重要的是在加入TrkA受體激活劑NGF-β后，槲皮素對(duì)低氧PASMCs抑制增殖、細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)其凋亡和抑制遷移的作用明顯減弱。

6、
　　結(jié)論：槲皮素可能是通過(guò)抑制TrkA/AKT信號(hào)通路發(fā)揮抑制低氧PASMCs增殖、細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)其凋亡和抑制其遷移從而緩解肺血管重塑，達(dá)到治療肺動(dòng)脈高壓的目的。
　　三、槲皮素通過(guò) FOXO1依賴的信號(hào)通路激活自噬，抑制自噬后槲皮素促進(jìn)低氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡增加
　　目的：進(jìn)一步深入探討槲皮素緩解低氧肺動(dòng)脈高壓（PH）的分子機(jī)制，明確細(xì)胞自噬行為有無(wú)參與其中。
　　方法：分離、培養(yǎng)大鼠PASMC，在Ox

7、ycycler model C21低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中建立細(xì)胞低氧模型。流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot和TUNEL細(xì)胞免疫熒光評(píng)估槲皮素促凋亡；電鏡、LC3細(xì)胞免疫熒光觀察細(xì)胞處理前后自噬形態(tài)學(xué)變化；構(gòu)建攜帶mRFP-GFP-LC3雙熒光的慢病毒觀察槲皮素對(duì)自噬流的影響；利用siRNA技術(shù)沉默F(xiàn)OXO1，SESN3，使用3MA抑制自噬，檢測(cè)槲皮素對(duì)自噬以及自噬對(duì)低氧PASMC增殖的影響。最后建立Sprague-Dawley大鼠PH模型

8、，在給予槲皮素的基礎(chǔ)上抑制自噬，觀察有無(wú)疊加效應(yīng)。
　　結(jié)果：槲皮素有效促進(jìn)低氧PASMC凋亡并促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。同時(shí)，槲皮素增加了低氧所激發(fā)的自噬以及上調(diào)自噬相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)，并增加自噬流的形成；槲皮素增加低氧FOXO1轉(zhuǎn)錄以及活性；抑制FOXO1表達(dá)后可有效增加mTOR以及其下游靶蛋白P70-S6K、4E-BPI的磷酸化，也明顯削弱槲皮素增加低氧所激發(fā)的自噬；此外，我們觀察到FOXO1通過(guò)上調(diào)SESN3表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)提高m